활용 칙 신경 튜브에서 뉴런의 유전 정의된 그룹 Axonal 경로를 벗기기 비켜에서 Electroporation

Summary

이 동영상은 이용 배아 여자 척수에서 뉴런의 유전자 정의된 그룹의 axonal 경로를 시각화하는 방법을 보여줍니다

Abstract

뉴런에서 기자 유전자의 표현 드라이브 향상제 요소의 고​​용은 axonal 투영를 추적하기위한 널리 사용되는 패러다임이다. 척추 동물에서 척추 interneurons의 axonal 투영을 추적하는 경우, 세균 라인 타겟 기자의 유전자가 좌우 대칭으로 대칭 상표를 얻을 수 있습니다. 따라서, 그것은 ipsi 및 콘트라 옆으로 돌출 axons을 구별하기 어렵습니다. 여자가 신경 튜브로 일방적 electroporation은 중추 신경계의 한쪽으로 리포터 유전자의 표현을 제한하고, 양쪽에 axonal 영사에 따라 유용한 수단을 제공

Protocol

I. Electroporation

에그 처리

1. 37-38 락을 쟁반과 함께 ° C, 바람직 인큐베이터에 humidified 보육 세트에 계란을 넣으십시오.
2. 그들이 햄버거 & 해밀턴 (HH) 단계에 18-20에 도달하면 배아는 부화의 66 시간 정도 후에 electroporated 있습니다. 이 단계에서는 머리 트렁크 (경추 굴곡라는 조건)와 같은 앞쪽에, 사후, 오른쪽과 왼쪽 vitelline의 정맥을 볼 수 정상적으로 엑스트라 배아 혈관의 광대한 설정 직각 놓여 있습니다. 이것은 확장기에 의존 특정 표현 ^1,3,4에 대한 최적의 무대입니다. 가능한 및 동기 배아를 얻기 위해서는, 온도와 보육의 습도를 모니터하는 것이 중요합니다.
3. 부화의 66 시간 후에, 인큐베이터에서 계란을 제거합니다. 수평 계란을 넣으십시오. 50~10분 기다립니다. 배아 이제 계란의 위쪽 기둥에 있습니다.

준비

1. 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S) (1:100 희석)와 행크의 솔루션을 준비합니다.
2. microcapillary에 유리 모세관 (0.5 mm 직경) 당기세요.
3. micromanipulator에 전극 (텅스텐)을 장소와 펄스 발생기 (ECM 830)에 전극을 연결합니다.
4. - 3, 펄스 50 MS의 길이 전압 30V, 펄스의 수를 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 펄스 발생기를 조정합니다.
5. 입 피펫, 주사기 바늘과 테이프를 준비합니다.
6. DNA (2-5μg/μl)의 원하는 혼합을 준비하고 빠른 그린 염료를 추가합니다.

윈도우와 electroporation

1. 주사기를 사용하여 각각의 난자에서 알부민의 5-6 ML를 제거합니다.
2. 작은 가위는 계란의 상단에 타원형 창을 열고.
3. 0.5 - 1ml 행크 + P / S 솔루션으로 젖은 배아.
4. 유리가 DNA 혼합물로 microcapillary 로드할 수, 입 피펫을 사용합니다.
5. 당신 향해 꼬리로 배아를 놓습니다. 이 단계에서 배아의 척수는 분명하게 볼 수 있습니다. 따라서, 어떤 대조 기술이 필요하지 않습니다. 척수는 양쪽의 머리와 꼬리를 봉인이지만, microcapillary 충분히 얇은 경우, 찔린 작은 구멍을하실 수 있으며 얕은 각도에 신경 튜브를 관통합니다. 오른쪽 직경 microcapillary는 DNA와 그것을 손상하지 않고 튜브를 침투하고 정기적으로 폭발로 DNA를 풀어 쉽게 로드할 수 있습니다.
6. 입 피펫을 사용하여 DNA를 주사. 녹색 염료 개발 두뇌의 vesicles까지 꼬리의 끝부분에서 전파해야합니다.
7. 튜브 자체 및 펄스을 건드리지 않고,로 할 수있는 근처의 신경 튜브에 병렬 전극을 삽입합니다. 펄스의 당시 전극은 전기 전도성을 허용에 대한 액체로 덮여 있어야합니다. 보통 행크의 구걸에 추가의 양은 충분합니다. 그렇지 않다면 펄스로 행크의 직전 한 방울을 추가합니다.
8. 조심스럽게 전극을 제거하고 테이프로 창문을 밀봉. 다음 잠복기 동안 배아의 건조 방지하기 위해 완전히 계란을 밀봉하는 것이 중요합니다.
9. 인큐베이터에있는 계란을 돌려 놓습니다.

II. 척수 오픈 책을 준비

배아에서 척수의 분리

1. 계란에서 E6에서 eletroporated 배아를 제거하고 PBS를 포함하는 실리콘과 코팅 페트리 접시에 놓으십시오.
2. 세포막을 버려야하고 개최 핀을 사용하여 자신의 복부 측면에있는 배아를 스트레치.
3. 날카로운 텅스텐을 사용하면 아래 꼬리로 hindbrain에서 지붕 판을 따라 세로 절개를 microcapillary.
4. 멀리 척수의 지느러미 루트 신경 (DRGs)를 분리, 척수의 양쪽에서 추가이 세로 incisions하십시오.
5. 척수는 그대로두고, 꼬리에서 hindbrain 시작 조직에서 바닥 플레이트를 분리합니다.
6. 좋은 가위를 사용하여 hindbrain에서 가로 섹션에서 척수를 잘라 본체에서 분리.

정치

1. 실리콘은 hindbrain에서 평면 장착 준비를 생산 꼬리에 그것을 잡아 핀을 사용하여 PBS를 포함하는 코팅 새로운 배양 접시에있는 분리된 척수를 벌리고.
2. 접시에서 PBS를 붓고 및 인산염 버퍼 호수의 4 % paraformaldehyde로 바꾸십시오.
3. 1 시간 동안 실온에서 알을 품다.

Immunohistochemistry

1. PBS의 기본 항체가 들어있는 유리병에 고정 척수를 전송합니다.
2. 4 박 이상의 부드러운 agitations로 품어 ° C.
3. PBS로 항체 X5 회, 부드러운 agitations 1 시간 동안 각 씻어 씻으십시오.
4. 이차 항체를 추가하고 4 박 이상의 부드러운 agitations로 품어 ° C.
5. 각 PBS와 항체 X5 번 씻으십시오부드러운 agitations 1 시간 동안 씻어.

이미징 장착 공개돼

1. 스미어 그리스이나 실리콘 슬라이드에 사각형 모양과 내에 PBS 드립.
2. 핀셋과 파스퇴르 피펫으로 주위의 액체를 밖으로 무승부를 사용하여 사각형의 중앙에 뻗어 척수를 놓습니다.
3. 척수에 장착 매체에서 한두 방울을 넣고 커버 전표로 커버. 스쿼시는 기포를 방지합니다.
4. 4 ° C.에 어두운 슬라이드를 유지
5. 공촛점 현미경을 사용하여 척수를 검사합니다.

Discussion

여자의 배아에 플라스미드 DNA의 Electroporation은 생체내 이소성 표현을위한 강력한 기술로 발전. 특정 강화하고, 여자의 electroporation의 결합 뉴런 ^1,3,5의 유전자 정의된 그룹의 axonal 경로를 파악을 위해 신속하고 효율적인 도구를 제공합니다. Cre 호텔 / LoxP 및 Gal4/UAS의 증폭 시스템을 활용하는 것은 표현의 수준 및 기간을 확대하실 수 있습니다. 새로운 그림들은 axonal 계획의 방향에 의해 정의된 interneuron의 subpopulations에서 발생 axonal 신호의 복잡한 발산입니다. 또한 두의 연결 인구의 동시 분자와 공간적 제한 라벨을 획득하실 수 있습니다. 따라서,의 연결 회로 ³ 아키텍처에 대한 정보를 제공합니다.