Summary
Objetivo de la presentación es mostrar un método altamente reproducible para generar la matriz asociada implantes de células madre en los defectos del cartílago, que puede ser visualizado con RM. Las células madre son etiquetados con aprobación de la FDA Ferumoxides, mezclado con agarosa, se implantan en los defectos del cartílago y la imagen con un escáner de MR 7T.
Abstract
El campo de la ingeniería de tejidos integra los principios de la biología de las células de ingeniería y la medicina hacia la regeneración de las células específicas del tejido funcional. Matriz asociada implantes de células madre (MASI) objetivo de regenerar los defectos del cartílago debido a las lesiones articulación artrítica o traumática. Las células madre adultas mesenquimales (MSC) tiene la capacidad de diferenciarse en células de la línea condrogénica y han mostrado resultados prometedores para tecnologías basadas en células de reparación del cartílago articular. MSC autólogas se pueden aislar de una variedad de tejidos, se puede ampliar en cultivos de células, sin perder su potencial de diferenciación, y han demostrado diferenciación condrogénica in vitro e in vivo 1, 2.
A fin de proporcionar la retención local y la viabilidad de las MSC trasplantadas en los defectos del cartílago, un andamio es necesario, lo cual también es compatible con la diferenciación y la proliferación posterior. La arquitectura de la formación de tejido andamio guías y los permisos de la matriz extracelular, producida por las células madre, para ampliar. Investigaciones anteriores han demostrado que un 2% de agarosa al andamio puede apoyar el desarrollo de cartílago hialino estable y no inducir respuestas inmunes 3.
Retención a largo plazo de las células madre trasplantadas en MASI es fundamental para la regeneración del cartílago. Etiquetado de MSC con nanopartículas de óxido de hierro permite a largo plazo en el seguimiento in vivo no invasivos MR técnicas de imagen 4.
En esta presentación se muestran las técnicas de MSC etiquetado con nanopartículas de óxido de hierro, la generación de agarosa células construcciones y la implantación de estas construcciones en los defectos del cartílago. Las construcciones de la etiqueta puede ser rastreado de forma no invasiva con MR-Imaging.
Protocol
1. Etiquetado de hMSCs con Endorem
- Las células se cultivan en la confluencia del 80% al menos 18 horas antes de su etiquetado.
- Durante este tiempo, los medios de comunicación etiquetado se prepara añadiendo Endorem a la muestra en una dosis de 100 ug de Fe / ml de suero libre de los medios de comunicación.
- Después de las células son cultivadas a la confluencia, la cultura mediática que se aspira y se lavan las células con PBS 1x o los medios de comunicación libres de suero.
- A continuación, la solución de lavado se aspira y los medios de comunicación etiquetado previamente preparada se añade. Las células se incubaron a 37 º C, 5% CO 2 durante 4 horas.
- Después de la incubación de 4 horas, el etiquetado de medios que se aspira y las células se lavan con PBS y se trypsinized, como de costumbre.
- Una vez trypsinized, se lavan las células 3 veces con PBS y se centrifuga a 400rcf durante 5 minutos.
- Después de este paso de lavado, las células se volvieron a suspender, se cuentan para determinar la viabilidad, y utilizar cuando sea necesario para la experimentación.
2. Preparación de agarosa
- Después que las células se han etiquetado es el momento de preparar la solución de agarosa.
- En una escala bien, 80 mg de polvo de agarosa se pesan y se añade 2 ml de PBS.
- Esta solución se agita suavemente y autoclave.
- Después de aproximadamente 40 minutos, el líquido de una solución de agarosa se puede sacar del autoclave. El volumen debe ser medido y ajustado de acuerdo con PBS precalentado.
- Entonces la solución se enfría a 42 ° C
3. La creación de MASI
- Cuando la solución de agarosa ha alcanzado la temperatura deseada, las células se cuentan y se centrifuga por última vez en un tubo de 1,5 ml Eppendorf.
- Después de la centrifugación, el sobrenadante se descarta y las células se mezclan con el DMEM para llegar a una concentración de 30 x 10 6 células / ml.
- Ahora que las células se mezclan con los 42 ° C caliente de agarosa.
- Una punta de la pipeta al frío puede causar agarosa para consolidar dentro de la punta, por lo tanto se recomienda precalentar el extremo caliente al vaso PBS estéril hacia arriba y abajo
- Ahora, el mismo volumen de agarosa, tal como los medios de comunicación es tomada y se mezcla bien con la célula-los medios de comunicación de suspensión a fin de que una suspensión homogénea se crea.
- Mantenga el tubo de Eppendorf en un baño de agua precalentada mientras se mezcla para que la agarosa no se enfría lo suficiente para solidificarse.
- Cuando la suspensión sea homogénea, las células se implantan en el defecto.
Figura 1. Coronal imágenes ponderadas en T2 SE (TR 4000 ms / TE 18,27 ms) de una muestra de la rótula con hMSCs implantado en los defectos del cartílago.
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Discussion
El protocolo descrito proporciona una forma reproducible a la etiqueta MSC con nanopartículas de óxido de hierro y estos implantes etiqueta MSC en los defectos del cartílago. Esta técnica no invasiva permite la representación de los trasplantes de células madre en los defectos del cartílago de la RM, que permite una detección precoz de la insuficiencia MASI. Una dislocación o salida de las células marcadas se puede diagnosticar sobre la base de una desaparición de la etiqueta en el sitio del trasplante en las imágenes de RM. Un diagnóstico precoz de estos eventos es deseable y sería evitar que el paciente innecesarios procedimientos alternativos de diagnóstico invasivos. El descrito método no invasivo para el diagnóstico de los resultados MASI podría ayudar en el desarrollo exitoso de las terapias basadas en células para la regeneración del cartílago en la artrosis. El protocolo se aplica actualmente en estudios preclínicos en estudios in vivo, sería en principio aplicable clínicamente y podría servir como medida de resultado no invasiva para la evaluación de las terapias MASI en la práctica clínica.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas piel, NIH RO1AR054458.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | ||
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25399-120 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | ||
| Ferumoxides (Endorem) | Guerbet | |||
| Agarose Typ VII | Sigma-Aldrich | A9045 | Dilute Agarose in PBS to final concentration of 4% |
References
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).
- Pittenger, M. F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Rahfoth, B. Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging. J Vis Exp. , (2008).
