Summary
Objetivo da apresentação é mostrar um método altamente reprodutível para gerar matriz associada implantes de células-tronco em defeitos da cartilagem, que pode ser visualizado com ressonância magnética. As células estaminais são rotulados com FDA-approved Ferumoxides, misturado com agarose, implantado em defeitos da cartilagem e fotografada com um scanner MR 7T.
Abstract
O campo da engenharia de tecidos integra os princípios da engenharia de biologia celular e medicina para a regeneração de células e tecidos específicos funcional. Matriz associada implantes de células-tronco (MASI) visam regenerar defeitos da cartilagem devido à artrite traumática ou lesões nas articulações. Células-tronco adultas mesenquimais (CTMs) têm a capacidade de se diferenciar em células da linhagem condrogênicos e têm mostrado resultados promissores para celular baseado em tecnologias de reparação da cartilagem articular. Autólogo MSCs pode ser isolado de uma variedade de tecidos, pode ser expandida em culturas de células, sem perder seu potencial de diferenciação, e demonstraram diferenciação condrogênicos in vitro e in vivo 1, 2.
A fim de proporcionar a retenção local e viabilidade de MSCs transplantado em defeitos de cartilagem, um andaime é necessário, que também suporta a diferenciação e proliferação subsequente. A arquitetura da formação de tecido scaffold guias e permite a matriz extracelular, produzida pelas células-tronco, a se expandir. Investigações anteriores demonstraram que a 2% agarose andaime pode apoiar o desenvolvimento de cartilagem hialina estável e não induzir respostas imunes 3.
Retenção a longo prazo de células-tronco transplantadas em MASI é fundamental para a regeneração da cartilagem. Rotulagem de CTMs com nanopartículas de óxido de ferro permite a longo prazo no rastreamento vivo com técnicas não invasivas RM 4.
Esta apresentação vai demonstrar técnicas para a rotulagem MSCs com nanopartículas de óxido de ferro, a geração de células-agarose construções e implantação dessas construções em defeitos da cartilagem. As construções rotulado pode ser rastreado de forma não invasiva com MR-Imaging.
Protocol
1. Rotulagem de hMSCs com Endorem
- As células são cultivadas a 80% confluência pelo menos 18 horas antes de rotulagem.
- Durante este tempo, a mídia rotulagem é preparada adicionando Endorem à amostra com uma dose de 100 ug Fe / ml de soro livre de mídia.
- Depois que as células são cultivadas de confluência, a cultura da mídia é aspirado e as células são lavadas com PBS 1x ou soro livre de mídia.
- Em seguida, enxágüe a solução é aspirada e da mídia rotulagem previamente preparado é adicionado. As células são então incubados a 37 ° C, 5% de CO 2 para 4 horas.
- Após a incubação de 4 horas, rotulagem mídia é aspirado e as células são lavadas com PBS e tripsinizados como de costume.
- Uma vez tripsinizados, as células são lavadas 3x com PBS e centrifugado a 400rcf por 5 minutos.
- Após esta etapa de lavagem, as células são ressuspendidas, contados, avaliadas quanto a viabilidade, e usado quando necessário para a experimentação.
2. Preparando Agarose
- Depois que as células foram marcadas é hora de preparar a solução de agarose.
- Em uma escala bem, 80mg de agarose em pó são pesados e adicionados 2 ml de PBS.
- Esta solução é, então, suavemente sacudida e autoclavada.
- Depois de aproximadamente 40 min, a solução de agarose líquido pode ser retirado da autoclave. O volume deve ser medido e ajustado em conformidade com PBS pré-aquecido.
- Então a solução é resfriada a 42 ° C
3. Criando MASI
- Quando a solução de agarose atingiu a temperatura desejada, as células são contadas e centrifugado pela última vez em um tubo Eppendorf de 1,5 ml.
- Após a centrifugação, o sobrenadante é descartado e as células são misturadas com o DMEM para chegar a uma concentração de 30 x 10 6 células / ml.
- Agora as células são misturadas com a 42 ° C agarose quente.
- A ponta da pipeta frio pode causar agarose para solidificar no interior da ponta, portanto é aconselhável para pré-aquecer a ponta por pipetagem quente estéril PBS cima e para baixo
- Agora, o mesmo volume de agarose como meios de comunicação é retomada e misturado com a célula-media suspensão, de modo que uma suspensão homogênea é criado.
- Manter o tubo Eppendorf dentro de um banho de água pré-aquecida enquanto mistura de modo que a agarose não esfriar o suficiente para solidificar.
- Quando a suspensão é homogênea, as células são implantadas no defeito.
Figura 1. Coronal T2 SE (TR 4000 ms / TE 18,27 ms) de uma amostra de patela com hMSCs implantado em defeitos da cartilagem.
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Discussion
O protocolo descrito fornece uma maneira reproduzível para rotular MSCs com nanopartículas de óxido de ferro e implante essas MSCs rotulados em defeitos da cartilagem. Essa técnica permite não-invasivo representação de transplantes de células-tronco em defeitos da cartilagem com ressonância magnética, que permite uma detecção precoce de falha MASI. A luxação ou de efluxo das células marcadas pode ser diagnosticada com base em um desaparecimento do rótulo do site transplante em imagens de MR. Um diagnóstico precoce desses eventos é desejável e que impedem o paciente de alternativas desnecessários procedimentos invasivos de diagnóstico. O descrito método não-invasivo para diagnosticar resultados MASI poderia ajudar no desenvolvimento bem sucedido de terapias celulares para a regeneração da cartilagem com base na osteoartrite. Nosso protocolo é aplicado atualmente em pré-clínicos in vivo estudos, seria, em princípio, clinicamente aplicável e poderia servir como não-invasiva medida de desfecho para a avaliação de terapias MASI na prática clínica.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma doação do Instituto Nacional de Artrite e Doenças da Pele músculo-esqueléticas, NIH RO1AR054458.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | ||
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25399-120 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | ||
| Ferumoxides (Endorem) | Guerbet | |||
| Agarose Typ VII | Sigma-Aldrich | A9045 | Dilute Agarose in PBS to final concentration of 4% |
References
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).
- Pittenger, M. F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Rahfoth, B. Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging. J Vis Exp. , (2008).
