Summary
Objectif de la présentation est de montrer une méthode hautement reproductible pour générer la matrice associée implants de cellules souches dans les lésions du cartilage, qui peuvent être visualisées avec l'IRM. Les cellules souches sont étiquetés avec approuvée par la FDA Ferumoxides, mélangés avec l'agarose, implantés dans les lésions du cartilage et imagé avec un scanner IRM 7T.
Abstract
Le domaine du génie tissulaire intègre les principes de l'ingénierie, la biologie cellulaire et en médecine vers la régénération des cellules spécifiques et des tissus fonctionnels. Matrice des implants de cellules souches associées (MASI) visent à régénérer les défauts du cartilage due à l'arthrite ou de lésions traumatiques commune. Adulte cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont la capacité de se différencier en cellules de la lignée chondrocytaire et ont montré des résultats prometteurs pour les technologies basées sur les cellules articulaires réparation du cartilage. Autologue MSC peut être isolé d'une variété de tissus, peut être étendu dans les cultures cellulaires sans perdre leur potentiel de différenciation, et ont démontré la différenciation chondrocytaire in vitro et in vivo 1, 2.
Afin d'assurer la rétention locale et la viabilité des cellules souches mésenchymateuses transplantées dans les lésions du cartilage, un échafaudage est nécessaire, qui prend également en charge de différenciation et la prolifération subséquente. L'architecture de la formation des guides et des tissus échafaudage permet la matrice extracellulaire, produite par les cellules souches, à se développer. Des recherches antérieures ont montré que 2% d'agarose échafaudage peut soutenir le développement du cartilage hyalin stable et ne pas induire des réponses immunitaires 3.
Conservation à long terme des cellules souches transplantées dans le MASI est essentiel pour la régénération du cartilage. Étiquetage des CSM avec des nanoparticules d'oxyde de fer permet à long terme dans le suivi in vivo avec des techniques non invasives d'imagerie IRM 4.
Cette présentation fera la démonstration des techniques de MSC étiquetage avec des nanoparticules d'oxyde de fer, la génération de cellules-agarose des constructions et l'implantation de ces constructions dans des défauts du cartilage. Les constructions étiquetées peuvent être suivis de façon non invasive avec MR-imagerie.
Protocol
1. Étiquetage des hMSCs avec Endorem
- Les cellules sont cultivées à 80% de confluence d'au moins 18 heures avant l'étiquetage.
- Pendant ce temps, les médias étiquetage est préparé en ajoutant à l'échantillon Endorem à une dose de 100 ug Fe / ml du milieu sans sérum.
- Après les cellules sont cultivées jusqu'à confluence, la culture médiatique est aspirée et les cellules ne sont lavées avec du PBS 1x ou un milieu sans sérum.
- Ensuite, la solution de rinçage est aspiré et les médias d'étiquetage préalablement préparé est ajouté. Les cellules sont ensuite incubées à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 4 heures.
- Après 4 heures d'incubation, l'étiquetage des médias est aspiré et les cellules sont rincées avec du PBS et la trypsine, comme d'habitude.
- Une fois trypsinées, les cellules sont lavées 3x avec PBS et centrifugés à 400rcf pendant 5 minutes.
- Après cette étape de lavage, les cellules sont remises en suspension, compté, évalué pour la viabilité, et utilisés au besoin pour l'expérimentation.
2. Préparation d'agarose
- Après que les cellules ont été marqués, il est temps pour préparer la solution d'agarose.
- Sur une échelle plus fine, de 80 mg d'agarose en poudre sont pesés et ajoutés à 2 ml de PBS.
- Cette solution est ensuite agitée doucement et autoclavés.
- Après environ 40 min, la solution fluide agarose peuvent être retirés de l'autoclave. Le volume devrait être mesurée et ajustée en conséquence avec préchauffé PBS.
- Puis la solution est refroidie à 42 ° C
3. Créer MASI
- Lorsque la solution d'agarose a atteint la température désirée, les cellules sont comptées et centrifugé pour la dernière fois dans un tube Eppendorf de 1.5 ml.
- Après centrifugation, le surnageant est éliminé et les cellules sont mélangées avec le DMEM pour atteindre une concentration de 30 x 10 6 cellules / ml.
- Maintenant, les cellules sont mélangées avec de l'agarose 42 ° C au chaud.
- Une pointe de la pipette froid peut entraîner agarose à solidifier l'intérieur de la pointe, il est donc conseillé de préchauffer le bout par pipetage chaude PBS stérile haut et en bas
- Maintenant, le même volume d'agarose comme support est repris et soigneusement mélangé avec la cellule-media-suspension ainsi que d'une suspension homogène est créé.
- Garder le tube Eppendorf dans un bain d'eau préchauffée, tout en mélangeant afin que l'agarose ne refroidit pas assez pour se solidifier.
- Lorsque la suspension est homogène, les cellules sont implantées dans le vice.
Figure 1. Coronale pondérée en T2 images SE (TR 4000 ms / TE 18,27 ms) d'un spécimen de la rotule avec hMSCs implanté dans les lésions du cartilage.
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Discussion
Le protocole décrit fournit une manière reproductible à l'étiquette MSC avec des nanoparticules d'oxyde de fer et implanter ces étiquetés MSC dans des défauts du cartilage. Cette technique permet non invasive représentation de greffes de cellules souches à des défauts du cartilage en IRM, ce qui permet une détection précoce de l'échec MASI. Une luxation ou d'efflux des cellules marquées peuvent être diagnostiqués à partir d'une disparition de l'étiquette à partir du site de transplantation sur des images IRM. Un diagnostic précoce de ces événements est souhaitable et empêcher le patient de inutiles alternatives invasives procédures de diagnostic. Le décrite méthode non-invasive pour le diagnostic des résultats MASI pourrait aider à la réussite du développement de thérapies cellulaires pour la régénération du cartilage dans l'arthrose. Notre protocole est actuellement appliqué dans précliniques in vivo des études, seraient en principe applicables en clinique et pourrait servir de mesure des résultats non-invasive pour l'évaluation des thérapies MASI en pratique clinique.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de l'Institut national de l'arthrite et les maladies cutanées musculo-squelettiques, le NIH RO1AR054458.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | ||
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25399-120 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | ||
| Ferumoxides (Endorem) | Guerbet | |||
| Agarose Typ VII | Sigma-Aldrich | A9045 | Dilute Agarose in PBS to final concentration of 4% |
References
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).
- Pittenger, M. F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Rahfoth, B. Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging. J Vis Exp. , (2008).
