Summary
植物生物量是一个主要的碳中性的可再生资源，可用于生产生物燃料的使用。植物生物量主要由细胞壁，一个结构复杂的复合材料，被称为lignocellulosics。在这里，我们描述了协议的内容和墙派生碳水化合物组成的综合分析。
Abstract
可再生，碳中性的，和可持续发展的原材料行业和社会的需要，已成为面向21世纪的最紧迫的问题之一。这再度引发了在植物产品作为工业原料使用液体燃料的运输生产的兴趣
Protocol
1。细胞墙隔离
- 研磨约60 - 70mg的空气，或冷冻干燥与5.5毫米，在2毫升sarstedt使用retschmill（1分钟，25赫兹）的螺丝帽管不锈钢球的植物材料。另一种方法，使用一种高通量的研磨和配药机器人称为iWall是我 3部分。
- 删除，然后再继续与细胞壁分离过程的钢球
细胞壁物质准备详细的协议是在我3部分所示。为了完整的书面协议的步骤。 - 加1.5毫升70％的含水乙醇，旋涡彻底
- 以10,000 rpm离心10分钟沉淀不溶于酒精残留
- 吸出或倒出上清液
- 添加1.5毫升氯仿/甲醇（1:1 V / V）的解决方案去渣，动摇管，彻底悬浮颗粒
- 离心10分钟的转速为10,000和吸出或倒出上清液
- 重新悬浮颗粒的丙酮在500 UL
- 溶剂蒸发与空气流在35 ° C，直到干
如果需要干燥的样品可存放在室温，直到进一步的处理。 - 要开始重新悬浮颗粒在一个0.1M的sodiumacetate缓冲pH值5.0 1.5毫升样品的淀粉去除。
- 第20分钟sarstedt管和热。在80 ° C在加热块。
- 暂停在冰上冷却
- 添加下面的代理商颗粒：35微升0.01％Sodiumazide（南3），35μL淀粉酶（50μg/1mLH 2 O，芽孢杆菌的物种，西格玛）; 17μL普鲁兰（18.7芽孢杆菌acidopullulyticus单位;西格玛） 。第管和涡彻底。
- 悬挂在37℃摇床中的C孵育过夜。定向管水平助手改善混合。
- 热悬浮在100 ° C下10分钟，在加热块终止消化。
- 离心机（10,000 RPM，10分钟），并丢弃上清液含溶解的淀粉
- 洗，加入1.5毫升的水，振荡，centriguation，洗涤水调迁，其余颗粒三次。
- 重新悬浮颗粒的丙酮在500 UL
- 蒸发与干燥空气流在35 ° C，直到溶剂。这可能是必要的，也打破了管具有更好的干燥锅铲的材料。
干燥后的材料呈现孤立的细胞壁（lignocellulosics）。如果需要干燥的样品可存放在室温，直到进一步的处理。
2。矩阵多糖成分
这种方法实质上是一种修改Albersheim 1发表方法。
- 要确定墙体材料的单糖组成，重达2毫克2毫升starstedt管细胞进入墙体材料通过手工或使用iWall，机器人机器人研磨和称重一个highthroughput时尚。
- 新增20肌醇解决方案，作为内部标准（5mg/ml）UL。我们建议对于2毫克细胞壁样品中添加100微克。
- 250 UL丙酮冲洗管壁收集试管底部的细胞壁物质，丙酮蒸发下的气流非常温柔。
- 对于弱的酸水解2M三氟乙酸（TFA）每个样品中加入250 UL。添加TFA的仔细，以确保没有物质泼到管壁。
- 第紧密孵育90分钟，在121 ° C在加热块。
- 冷却加热块上的冰和样品。
- 10分钟10000转离心管。
- 包含派生的单糖，以确保不打扰颗粒材料的玻璃螺丝帽小瓶矩阵多糖的酸性上清转移100 UL。颗粒可以用下面的结晶纤维素测定（见3。）
- 蒸发装置中的温柔下的空气流蒸发TFA在玻璃管。
- 加入300μl2 - 丙醇，旋涡和蒸发在25℃（共3次重复）
- alditol醋酸衍生过程的第一步是执行其相应的alditols减少单糖。为此，添加200μL一个硼氢化钠溶液每个干燥样品。准备一个新鲜的解决方案，每次使用10毫克每1M的氢氧化铵1毫升，钠硼氢化。
- 离开玻璃小瓶，在室温下为1.5小时
- 中加入冰醋酸150 UL的解决方案
- 涡和蒸发在25℃。
- 加250μL醋酸酸/甲醇（1:9，V / V），旋涡和蒸发在25˚彗星
- 加250μL甲醇，根据气流和蒸发（共3次重复）
- 对于乙酰的alditols，添加50μL醋酸酐和50μL吡啶国家统计局，涡孵育20分钟，在121 ° C在加热块。
- 冰酷样品块，而等待温度降低到接近室温。
- 温柔流在室温下的空气中挥发的试剂。小心：alditol醋酸极易挥发。
- 加入200μl甲苯和在空气中蒸发（X3）
- 在最后的步骤alditol醋酸提取。首先，添加500 UL，醋酸乙酯和漩涡掉以轻心。
- 添加2毫升的水，盖管和旋涡。
- 5分钟2000转离心管获得明确的独立的层（醋酸乙酯，顶部底部的水）
- 移液器50 UL与插入瓶的GC / MS的醋酸乙酯层。
- 加入到GC小瓶和第100丙酮UL稀释。样品体积和稀释量可调节，以避免超载的GC / MS，如果样品浓度过高。
可存放于4℃，如果GC / MS分析不立即进行GC -小瓶 - 样品注入配备一个四极杆质谱，气相色谱，但火焰离子化检测器也适用。一个Supelco公司SP - 2380（30毫米x0.25毫米× 0.25微米薄膜厚度）列是一个4分钟的溶剂延迟和1.5ml/min的流速。注入样品经过下列程序升温：初始保持在160 ° 2分钟，C，20 ° C /分钟的斜坡至200℃，保持5 min; 20 ° C /分钟的斜坡至245 ° C和举行12分钟;秒杀到270 ° C和举行前5分钟冷却的初始温度为160 ° C 2.26）峰是由大规模的配置文件和/或标准的保留时间确定。单糖是量化的标准曲线。
3。结晶纤维素含量
这种方法实质上是Updegraf 8。有此过程的起始材料的数量：分离细胞墙体材料（见1）或墙体材料已经与2M TFA的（见2.8）要么其余颗粒酸处理后立即的（见2.8）或TFA的治疗颗粒，已与2 - 丙醇和干洗净。
- 添加TFA的颗粒螺丝皑皑的玻璃试管1毫升的Updegraff试剂（冰醋酸：硝酸：水，8时01分02秒V / V）。
- 第管得紧紧的，旋涡，热在加热块在100 ° C为30分钟。由于这种治疗方法的结果仍然不溶性的颗粒结晶纤维素。
- 在凉爽的块的样本在冰上室温或冷却器
- 15分钟10000转的离心机样本
- 弃上清，确保颗粒是不是感到不安，并没有从颗粒物质被删除。为了这个目的，离开约。 150 UL上清管。
- 加入1.5毫升的水，摇匀，离心，弃上清做上述
- 重复洗涤过程3，使用丙酮1.5毫升的额外时间
- 空气干燥颗粒，轻轻地与空气，或让替补席上干通宵
- 什么是所谓的Saeman水解，沉淀（结晶纤维素）现在已经完全水解成葡萄糖。为此sarstedt管加175μL72％硫酸
- 在室温下孵育30分钟，旋涡和另外15分钟的孵育
- 添加825μl水和涡
- 5分钟10000转的离心机样本。可能有一些棕色的不溶性物质，木质素，留在管。
- 上清的葡萄糖含量测定采用比色法蒽酮测定。这个实验是在96孔聚苯乙烯酶标板。
- 作标准曲线使用1mg/ml的葡萄糖股票（存储在0 ° C）和创建重复吹打0，2，4，6，8，和10 UL，0，2，4，6，8，和10微克的标准成单独的适当以及。填写每个水以及高达100 UL。
- 添加到单独的标准相同的微孔板细胞，但每个样品上清液10μL和90毫升的水。
- 加200μL新鲜配制的蒽酮试剂（蒽酮溶解在浓硫酸，蒽酮2毫克/毫升硫酸）
- 加热板为30分钟，在80℃（铝散热器）在烤箱。含葡萄糖的样品依次从黄到蓝绿色。
- 让冷却到室温的板，彻底动摇。
- 在625毫米，使用酶标仪读板吸收。
- 葡萄糖（因而结晶纤维素含量）计算吸光度标准曲线建立的同一个盘子。
4。代表性的成果
墙上分析的一个例子是在图2。在这种情况下，杨树干（木）协议部分所述的各种程序进行了分析。矩阵宝lysaccharide成分是通过一个例子来确定在植物细胞壁中的典型糖目前的色谱中强调，岩藻糖，鼠李糖，木糖，阿拉伯糖，半乳糖，甘露糖和葡萄糖（内部标准肌醇）。杨树的半纤维素主要成分是木聚糖，木糖含量高表明。然而，这些糖类丰富，会有所不同取决于原料used4。在这种分析中的葡萄糖是来自半纤维素xyloglucan和无定形纤维素。由于分析的数据可以作为MOL％或微克/毫克墙体材料（或干重）。结晶纤维素的内容是不言自明，可以预期值壁干重的20-50％之间。杨树木材的木质纤维组成，根据在这里提出，并在部分的I3的结果是21％的木质素，30％的半纤维素和41％的结晶纤维素。其余部分将灰。
图1：木质纤维分析概述。细胞壁（lignocellulosics）原油干植物材料隔离。墙体材料，然后加权成等份，并细分为各种检测。成立后，治疗用弱酸（2M TFA），墙体材料，alditol醋酸衍生产生的可溶性单糖，并通过GC - MS分析矩阵多糖成分。弱酸处理的残留物洗净，用所谓的Updegraff试剂背后只留下的不溶性crystlline纤维素。纤维素溶解的硫酸和由葡萄糖含量的测定比色法确定量化。同时，木质素的内容和组成可以判定，在我 3部分描述。
图2：杨树（ 胡杨tremoloides） 杨树木材的木质纤维综合分析木片所描述的协议。
左上：矩阵多糖成分; FUC岩藻糖，RHA鼠李糖，阿拉伯糖阿拉伯糖，木糖木糖，人甘露糖，半乳糖半乳糖; GLC葡萄糖，肌醇内部标准。
Discussion
描述的方法，使木质纤维植物的生物量组成的快速定量评估。该方法允许这种材料，包括糖组成，即基质多糖的半纤维素的结晶纤维素含量组成的决心。每人的各种分析方法的吞吐量不同。使用这里描述的协议，20个样本可以处理矩阵的多糖成分和结晶纤维素含量30。由于数据的最佳原料作物的定量性质，品种或基因型，可用于生产生物燃料的适用性评估。
Acknowledgments
我们非常感谢马修罗伯特韦瑟优质的技术服务和约翰拉尔夫，威斯康星大学的宝贵意见，讨论和杨木样本。这项工作是由化学，地球科学和生物科学部，基础能源科学，美国能源部科学办公室（奖励没有DE - FG02 - 91ER20021）和大湖的美国能源部（DOE）的办公室生物能源研究中心（美国能源部的BER办公室科学DE - FC02 - 07ER64494）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| myo-Inositol | Sigma-Aldrich | I5125 | |
| Sodium Borohydride | Sigma-Aldrich | 213462 | |
| Pyridine | JT Baker | 3348-01 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102 | |
| Spectromax Plus 384 | Molecular Devices | Plus384 | |
| GC-MS | Agilent Technologies | 7890A GC/5975C MSD | |
| 5.5mm Stainless Steel Balls | Salem Ball Company | (N/A) | |
| 96 well plate heat spreader | Biocision | Coolsink 96F | |
| Retsch Mill | Qiagen | TissueLyser II | |
| Heating block | Techne | Dri-block DB-3D | |
| Sample concentrator | Techne | FSC400D |
References
- Albersheim, P. A method for the analysis of sugars in plant cell wall polysaccharides by gas-liquid chromatography. Carbohydr. Res. 5, 340-340 (1967).
- Carroll, A., Somerville, C. Cellulosic Biofuels. Annu Rev Plant Biol. 60, 165-165 (2009).
- Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part I: Lignin. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).
- Somerville, C. Toward a systems approach to understanding plant-cell walls. Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).
- Teeri, T. T., Brumer, H. Discovery, characterisation and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endotransglycosylases. Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).
- UPDEGRAF, D. M. SEMIMICRO DETERMINATION OF CELLULOSE IN BIOLOGICAL MATERIALS. Anal. Biochem. 32 (3), 420-420 (1969).
