Summary
Bitki biyokütle, biyoyakıt üretimi için kullanılan olabilir önemli bir karbon-nötr yenilenebilir bir kaynaktır. Bitki biyokütle esas hücre duvarları, lignocellulosics olarak adlandırılan bir kompleks yapılara sahip kompozit malzemeden oluşmaktadır. Burada içerik ve duvar türetilen karbonhidrat bileşimi kapsamlı bir analiz için bir protokol.
Abstract
Yenilenebilir, karbon nötr, sanayi ve toplum için sürdürülebilir hammadde ihtiyacını 21. yüzyıl için en önemli sorunlardan biri haline gelmiştir. Bu ulaşım için sıvı yakıtların üretimi için endüstriyel hammadde olarak bitkisel ürünlerin kullanımı ilgi başlattı.
Protocol
1. Hücre duvar izolasyonu
- eziyet kabaca 60-70mg hava veya retschmill (1 dak, 25 Hz) kullanarak bir 2ml Sarstedt vidalı kapaklı tüp 5.5 mm paslanmaz çelik bilya ile kurutulmuş bitki materyali dondurmak. Bir alternatif, yüksek verimli bir taşlama ve robot olarak adlandırılan iWall dağıtım Part I 3 açıklanmıştır .
- hücre duvarı izolasyon prosedürü ile devam etmeden önce çelik topları kaldırmak
Hücre duvar malzemesi hazırlanması ayrıntılı protokol Part I 3 gösterilir. Protokol yazılı adımları burada tamlığı için. - 1.5 ml,% 70 sulu etanol ve iyice vorteks eklemek
- pelet için 10 dakika alkol çözünmeyen kalıntı 10.000 rpm'de santrifüj
- süpernatantı süzün veya aspirat
- kalıntı kloroform / metanol (1:1 v / v) solüsyonu 1.5 ml ekleyin ve iyice tüp sallamak pelet tekrar süspansiyon
- 10 dakika 10.000 rpm'de santrifüj ve supernatant süzün veya aspirat
- aseton 500 ul tekrar süspansiyon pelet
- 35 yaşında bir hava akışı ile solvent buharlaşması ° C kuruyana kadar
Gerekli kurutulmuş örnekleri daha fazla işlem kadar oda sıcaklığında saklanabilir. - Örnek 1,5 ml 0,1 M sodiumacetate tampon pH 5.0 yeniden askıya pelet nişasta kaldırılması başlatmak için.
- 20 dakika Sarstedt boru ve ısı kap. 80 ° C ısıtma bloğu.
- buz üzerinde süspansiyon serin
- pelet için aşağıdaki maddeler eklemek: 35 0.01% Sodiumazide ul (NaN 3), 35 ul Amilaz (50 μg/1mL H 2 O; Bacillus türleri, SIGMA), 17 ul Pullulanase (18.7 adet basil acidopullulyticus; SIGMA) . Ve iyice vorteks tüp kap.
- Süspansiyon 37 gece boyunca inkübe ° C çalkalayıcı. Tüpler yönlendirmek yatay yardımcıları karışım geliştirdi.
- ısı süspansiyon 100 ° C sindirim sonlandırmak için bir ısıtma bloğu 10 dk.
- santrifüj (10.000 rpm, 10 dakika) ve atın supernatant içeren çözünür nişasta
- 1.5 ml su ekleyerek karıştırın, centriguation ve çamaşır suyu şişeden kalan pelet üç kez yıkayın.
- aseton 500 ul tekrar süspansiyon pelet
- kuruyana kadar hava akımı 35 ° C ile solvent buharlaşır. Daha iyi kurutma için bir spatula ile tüp içindeki malzemeyi kırmak için de gerekli olabilir.
Kurumuş malzeme izole hücre duvarı (lignocellulosics) sunar. Gerekli kurutulmuş örnekleri daha fazla işlem kadar oda sıcaklığında saklanabilir.
2. Matrix Polisakarid kompozisyon
Bu yöntem, özünde Albersheim 1 tarafından yayımlanan yöntemi bir değişiklik.
- Duvar malzemesi monosakkarit kompozisyonunu belirlemek için, elle veya iWall, bir robot taşlama ve tartım robotu kullanarak highthroughput moda ya 2ml starstedt tüpler içine hücre duvar malzemesi 2 mg ağırlığındadır.
- , Bir internal standart olarak bir İnositol solüsyonu (5mg/ml) 20 uL ekleyin. 2 mg hücre duvarı örnek için 100 ug eklemek için önerilir.
- tüpün alt hücre duvarı malzeme toplamak için tüp duvarları 250 ul aseton ile temizleyin, durulayın ve aseton çok hafif hava akımı altında buharlaşması.
- Zayıf asit hidrolizi için her numune 2M trifloroasetik asit (TFA) 250 ul ekleyin. Hiçbir malzeme tüp duvarlarına sıçrayan sağlamak için dikkatle TFA ekleyin.
- sıkı kapağı ve 121 90 dakika boyunca inkübe ° C ısıtma bloğu.
- ısıtma blokları ve örnekler buz üzerinde soğutun.
- Tüpleri 10 dakika 10.000 rpm'de santrifüj.
- pelet malzeme rahatsız değil emin olun bir bardak vidalı kapaklı şişeleri monosakkarit elde edilen matris polisakkarit içeren asidik süpernatant 100 ul aktarın. Pelet (3) aşağıdaki kristalin selüloz tayini için kullanılan
- hafif bir hava akımı altında bir buharlaştırma cihazı, cam tüp içinde TFA buharlaşır.
- 300 ul 2-Propanol, girdap ve buharlaşması 25 ° C (toplam üç kez tekrar)
- Alditol asetat türevlendirme prosedürün ilk adımı, bunlara karşılık gelen alditols Monosakkaritler bir azalma yapmaktır. Bu amaçla her kurutulmuş örnek bir çözüm sodyum bor hidrür, 200 ul ekleyin. Taze bir çözüm her zaman başına 1M Amonyum hidroksit 1 ml sodyum bor hidrür 10mg kullanarak hazırlayın.
- Cam şişe, 1,5 saat boyunca oda sıcaklığında terk
- 150 ul buzul asetik asit ekleyerek çözüm nötralize
- 25 girdap ve buharlaşması ° C.
- 250 ul asetik asit / Metanol (01:09 v / v), girdap ve 25 buharlaşmaya ˚ C
- (toplam üç kez tekrar) 250 ul Metanol ekleyin ve hava akışı altında buharlaşması
- Alditols asetilasyonu için asetik anhidrit, 50 ul ve Pyrid 50 ul ekleyin20 dakika için 121 ine, girdap ve inkübe ° C ısıtma bloğu.
- buz bloğu serin numuneler oda sıcaklığında yaklaşık için geçici azalma beklerken.
- reaktifler oda sıcaklığında hafif bir hava akımı altında buharlaşır. Dikkatli olun: alditol asetatlar havai.
- hava altında 200 ul Toluen ekleyin ve buharlaşması (x3)
- Son adımları alditol asetatlar ayıklanır. İlk olarak, etil asetat ve hafifçe girdap 500 ul ekleyin.
- 2 ml su, şapka tüpleri ve vorteks ekleyin.
- net ayrı katmanlarda (etil asetat, üst alt su) elde etmek için 5 dakika için 2,000 RPM tüpler santrifüj
- GC / MS ekler ile şişeleri içine etil asetat tabaka pipet 50 ul.
- aseton 100 ul GC-şişe ve kapak ekleyerek sulandırmak. Örnek konsantrasyonu çok yüksek ise, örnek hacmi ve seyreltme hacim GC / MS aşırı yüklenmesini önlemek için ayarlanabilir.
GC-flakon, 4 ° C, GC / MS analizi hemen devam gelmez eğer saklanabilir - Numuneleri, bir quadrupole MS ile donatılmış bir GC enjekte ama alev iyonizasyon dedektörü de uygundur. Supelco SP-2380 (30mm X 0.25mm x 0.25 mikron film kalınlığı) sütun 4min çözücü bir gecikme ve 1.5ml/min bir akış hızı ile kullanılır. Enjekte örnekleri aşağıdaki sıcaklık programına tabi tutulur: 160 İlk tutun ° C için 2 dk, 20 ° ile 200 C / dak rampa ° C ve 5 dakika boyunca tutun; 20 ° ile 245 C / dak rampa ° C ve basılı tutun 12 dakika; başak 270 ° C ve 160 ° C 2,26 ilk sıcaklık soğutma önce 5 dakika boyunca basılı tutun) Peaks kitle profilleri standartlar ve / veya alıkonma süreleriyle tanımlanır. Monosakkaritler standart eğrileri dayalı sayısal vardır.
3. Kristal Selüloz İçerik
Bu yöntem aslında Updegraf 8 tarafından açıklanmıştır. İzole hücre duvar malzemesi (1) veya zaten 2M TFA (2.8 'e bakınız) ya kalan pelet asit tedavisi hemen sonra (2.8) veya TFA ile tedavi edildikten duvar malzemesi: Bu prosedür için başlangıç materyali sayısı vardır pelet, 2-propanol ve kuru ile yıkanır olmuştur.
- Updegraff reaktif vidalı kapaklı cam tüp 1 ml (nitrik asit: su, 08:01:02 v / v asetik asit) TFA pelet ekleyin.
- Kapağını sıkıca kapatın tüp 100 ısıtma bloğu, girdap ve ısı ° C de 30 dakika. Bu tedavinin bir sonucu olarak sadece kristal selüloz pelet çözünmez kalır.
- Blok, oda sıcaklığında veya soğuk buz üzerinde soğutun örnekleri
- 15 dakika 10.000 rpm'de santrifüj örnekleri
- Pelet ve kaldırılır rahatsız pelet hiçbir malzeme olmadığı sağlamak süpernatant atın. Bu amaçla yaklaşık bırakın. 150 tüp süpernatant ul.
- santrifüj sallamak, 1.5 ml su ekleyin ve yukarıda yaptığımız gibi süpernatant atın.
- 1.5 ml aseton kullanarak işlem 3 kez yıkama tekrar
- Hava kuru pelet hava ile çok nazik ya da geceleme bankta kurumaya bırakın
- pelet (kristal selüloz) Saeman hidroliz ne denir artık tamamen glikoza hidrolize olur. Bu amaçla Sarstedt tüp 175 ul% 72 Sülfürik asit eklemek için
- başka bir 15 dakika için 30 dakika, girdap ve inkübe oda sıcaklığında inkübe
- 825 ul su ve vorteks eklemek
- 5 dakika 10.000 rpm'de örnekleri santrifüj. Tüp içinde kalan bazı kahverengi çözünmez malzeme, lignin, olabilir.
- Süpernatantı glikoz içeriği kolorimetrik anthrone assay kullanılarak denenmiştir. Bu testte 96 polistiren mikrotiter plate yapılır.
- Standart eğri 1mg/ml şekeri stoku (0 ° C'de depolanan) ve 0, 2, 4, 6, 8 ve 10 ul pipetleme, 0, 2, 4, 6, 8, ve 10 ug standartları kopyasını oluşturmak için ayrı uygun bir kuyuya. Her iyi 100 ul su ile doldurun.
- ayrı hücrelere ancak standart olarak aynı mikrotiter plate ul her örnek süpernatant 10 ve 90 ml su ekleyin.
- taze hazırlanmış Anthrone Reaktif (Anthrone konsantre sülfürik asit, 2 mg anthrone / ml sülfürik asit içinde çözünmüş), 200 ul eklemek
- 80 az 30 dakika ısı plakası ° C fırında (alüminyum ısı yayıcı). Glikoz içeren örnekler, sarı, mavi-yeşil renge çevirin.
- plaka oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin ve iyice çalkalayın.
- mikrotiter plate okuyucusu kullanarak 625 mm plaka emilimini okuyun.
- Glikoz (ve dolayısıyla kristal selüloz içeriği) absorbans dayalı, aynı plaka üzerine kurulmuş standart eğri göre hesaplanır.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Bir duvar analizi bir örnek Şekil 2'de sunulmuştur. Bu durumda kavak kök (ağaç) protokol bölümünde belirtilen çeşitli işlemler analiz edildi. Matris polysaccharide yapısı, bitki hücre duvarları tipik şeker mevcut tanımlayan bir örnek kromatogram vurgulanır, fucose, ramnoz, ksiloz, arabinoz, galaktoz, mannoz ve glikoz (ve iç standart inositol). Yüksek Xylose içeriği tarafından gösterildiği gibi, kavak başlıca hemicellulosic bileşeni Xylan. Ancak, bu şekerlerin bol miktarda hammadde used4 bağlı olarak değişecektir. Bu analizde glikoz ve amorf selüloz hemiselüloz xyloglucan türetilmiştir. Veri analizi sayesinde mol% veya ug / mg duvar malzemesi (veya kuru ağırlık) olarak sunulabilir. Kristalin selüloz içeriği kendi kendini açıklayıcı, bir duvar kuru ağırlığının% 20-50 arasında değerler bekleyebilirsiniz. Bölüm I3 ve burada sunulan sonuçlar dayanarak kavak ağacından lignocellulosic kompozisyonu% 21 lignin,% 30 hemiselüloz ve% 41 kristal selüloz. Geri kalan kül olacaktı.
Şekil 1: lignocellulosic analiz Genel Bakış Hücre duvarları (lignocellulosics) ham kurutulmuş bitki materyali izole edilmiştir. Duvar malzemesi, sonra alikotları içine ağırlıklı ve çeşitli deneyleri için bölünmüştür. Matrix polisakkarit kompozisyon duvar malzemesi, zayıf bir asit (2M TFA) ile tedavi alditol asetatlar elde edilen çözünür Monosakkaritler derivatizing, ve GC-MS analizi sonra kurulmuştur. Zayıf asit tedavisi kalıntı sözde Updegraff reaktif geride bırakarak sadece çözünmez crystlline selüloz ile yıkanır. Selüloz sülfürik asit çözünür ve glikoz içeriği belirleyen bir kolorimetrik yöntemi ile sayısal. Buna paralel olarak, Bölüm I 3 açıklandığı gibi lignin içeriği ve bileşimi tespit edilebilir.
Şekil 2: kavak (Populus tremoloides) kavak ahşap Kapsamlı lignocellulosic analiz Ahşap cips açıklanan protokole tabi tutuldu.
Sol üst: Matrix polisakkarit bileşimi; FUC fucose; Rha ramnoz; Ara arabinoz; Xyl ksiloz Man mannoz, galaktoz Gal GLC glikoz; inositol internal standart.
Discussion
Açıklanan yöntemlerden lignocellulosic bitki biyokütle kompozisyon hızlı bir nicel değerlendirmesini sağlar. Yani matris polisakkaritler hemiselülozlar şeker kompozisyonu, kristalin selüloz içeriği de dahil olmak üzere, bu malzemelerin bileşimi belirleme yöntemi sağlar. Kişi başına düşen çeşitli analitik yöntemlerin hacmi değişir. Burada açıklanan protokolleri kullanarak, 20 örnekleri kristal selüloz içeriği için matris polisakkarit kompozisyonlar ve 30 işlenebilir. Nicel veri en uygun hammadde bitkileri doğası nedeniyle, çeşitli veya genotipler, biyoyakıt üretimi için kendi uygunluk açısından değerlendirilebilir.
Acknowledgments
Biz mükemmel teknik servis ve John Ralph, University of Wisconsin için değerli tavsiyeler, tartışmalar ve kavak ahşap örnek Matthew Robert Weatherhead için minnettarız. Bu çalışma, Kimya Bilimleri, Yerbilimleri ve Biosciences Bölümü, Temel Enerji Bilimler, Fen Dairesi, ABD Enerji Bakanlığı (ödül hayır. DE-FG02-91ER20021) ve ABD Enerji Departmanı (DOE) tarafından Büyük Göller Dairesi tarafından finanse edildi Biyoenerji Araştırma Merkezi (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| myo-Inositol | Sigma-Aldrich | I5125 | |
| Sodium Borohydride | Sigma-Aldrich | 213462 | |
| Pyridine | JT Baker | 3348-01 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102 | |
| Spectromax Plus 384 | Molecular Devices | Plus384 | |
| GC-MS | Agilent Technologies | 7890A GC/5975C MSD | |
| 5.5mm Stainless Steel Balls | Salem Ball Company | (N/A) | |
| 96 well plate heat spreader | Biocision | Coolsink 96F | |
| Retsch Mill | Qiagen | TissueLyser II | |
| Heating block | Techne | Dri-block DB-3D | |
| Sample concentrator | Techne | FSC400D |
References
- Albersheim, P. A method for the analysis of sugars in plant cell wall polysaccharides by gas-liquid chromatography. Carbohydr. Res. 5, 340-340 (1967).
- Carroll, A., Somerville, C. Cellulosic Biofuels. Annu Rev Plant Biol. 60, 165-165 (2009).
- Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part I: Lignin. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).
- Somerville, C. Toward a systems approach to understanding plant-cell walls. Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).
- Teeri, T. T., Brumer, H. Discovery, characterisation and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endotransglycosylases. Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).
- UPDEGRAF, D. M. SEMIMICRO DETERMINATION OF CELLULOSE IN BIOLOGICAL MATERIALS. Anal. Biochem. 32 (3), 420-420 (1969).
