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Biology

液相恢复GELFREE 8100分馏系统使用基于分子量分馏

doi: 10.3791/1842 Published: December 3, 2009

Summary

影随行介绍GELFREE 8100分馏系统的使用,哪些分区复杂的蛋白质样品分子量的基础上,并恢复在液相组分。视频描述技术如何工作,如何使用它,并提供与分割牛的肝组织匀浆的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析得到的数据,。

Abstract

GELFREE 8100分馏系统是一种新的蛋白质分馏系统的设计,以最大限度地提高蛋白质在分子量基于分馏恢复。该系统由单用,8样本容量墨盒和台式GELFREE分馏仪器。在分离,应用的阳极和阴极水库之间的电压恒定,每个蛋白质混合物到一个特别设计的凝胶柱凝胶电泳从装载室的驱动。蛋白质都集中到一个严密乐队在浓缩胶和分离的基础上各自的一个解决凝胶电泳迁移率。蛋白质洗脱列,他们被困在液相集中在收集室, 免费的凝胶。该仪器是在特定的时间间隔,然后暂停,并用吸管收集分数。重复这一过程,直到所有需要的分数已收集。如果少于8个样本的墨盒上运行,可用于任何未使用的商会,在随后的分离。

这种新颖的技术,有利于快速和简单的分离复杂的蛋白质混合物的同时,和以前提供的分馏方法相比,提供了多种优势。该系统能够分馏高达1mg的每通道的总蛋白,每个墨盒8mg。较广泛的群众范围内的完整蛋白质的分离分子量的基础上,保留重要的分析物的理化性质。液相包封提供,同时消除了乐队或现场切割的需要,使分馏过程的高度重复性1,回收率高。

Protocol

1。样蛋白的制备

  1. 在500μL的离心管中,结合以下内容:
试剂卷补充:
*蛋白质样品(1毫克) 至112μL
在墨盒套件提供的样品缓冲液(5X ) 30μL
数码地面电视1M 8μL
18ΩH 2 O x微升到总样本量150μL**
  1. 变性的样品在95℃5分钟。冷却至室温。

*要分开的蛋白质的总金额将取决于样品的复杂性。 对于更复杂的样品,如组织匀浆,建议150-200微克每通道

**如果样品体积小于112μL,加18ΩH 2 O,使最终体积为150μL。

2。载入GELFREE盒

  1. 删除GELFREE 8100盒,铝箔袋。
  2. 删除和丢弃的板盖。
  3. 使用吸液管从墨盒车厢中取出的存储缓冲区。如果墨盒的所有8个商会将被使用,墨盒可以倒排从车厢内的存储缓冲区。
  4. 墨盒准备要加载的GELFREE运行缓冲液中加入每个墨盒商会如下:
GELFREE墨盒会所 GELFREE运行缓冲液中添加量
阳极缓冲水库 8毫升
阴极缓冲水库 6毫升
收集商会各加入100μL
  1. 取下并丢弃任何缓冲区从样品装载室。
  2. 150μL的样品装入加载使用一个8通道移液器的商会。
  3. 装入墨盒放入GELFREE 8100分馏站。降低电极阵列,并盖上盖子。

3。运行墨盒

  1. 使用该仪器的触摸屏显示,按方法 “按钮,以查看预编程的方法列表。预编程的方法组成,每个设置的电压和时间为基础的,旨在解决一个特定范围的分子量内的蛋白质暂停。 GELFREE 8100会自动暂停馏分收集方法在指定的时间间隔。
  2. 一旦适当的方法已经确定,按检索按钮,并输入所需的预编程的方法使用屏幕上的键盘。按“OK”,然后按Apply按钮。该方法已应用于将出现在主屏幕的底部。
  3. 要选择的渠道(样本数),将用于在运行时,按主屏幕上的频道按钮。要选择所有八个通道,按全部选择。然后,按返回到主屏幕。
  4. 确保安全盖被关闭,并且在屏幕底部的指示灯是绿色的。
  5. 要开始的蛋白质分离,按开始 。分馏站将自动暂停,当它的时间来收集馏分注意:当系统运行时,显示在屏幕左侧的框中的圆圈描绘每个通道的状态。 绿色圆圈表示的通道被激活,一个黄色的圆圈表示,该仪器已暂停,和一个红色圆圈表示该通道已失败。适用的电压和电流显示通道状态界的权利。 分数只应删除时的状态界变为黄色和仪器的屏幕上出现一个文本警报。
  6. 要删除分数,打开仪器盖,并使用一个8通道移液器撤回150μL每个收集室。
  7. 一旦分数已被删除,用GELFREE运行缓冲液收集室两次,加入100μL,每通道,吹打起来,上下两次。
  8. 洗涤后,加入100uL GELFREE运行到缓冲区回来的收集室,盖上盖子,按下继续按钮。
  9. GELFREE 8100将运行,直到下一次的时间间隔。在实验中剩余的总时间显示在屏幕的右侧。 剩余时间之间切换,时间过去了,暂停时间,按下按钮,上面显示的时间框。
  10. 一旦所有的分数已经合作llected,他们可以立即被用于进一步的下游制剂,如等电聚焦电泳,或使用液相色谱质谱或免疫分析。

4。代表性的成果

被分成12分数每一个牛的肝组织匀浆200微克,使用GELFREE分馏系统。 6μL每个分数上运行一个标准的一维SDS - PAGE凝胶银染。如图1所示,蛋白质样品分割成12个不同的分数,跨越分子量范围从3.5kDa 150kDa。分子量标准(ColorBurst,Sigma公司)也显示在1和14道。此处所示的凝胶,强调通过对蛋白质的分离GELFREE 8100系统的高回收率。此处所示的凝胶代表从200微克的蛋白质的4%。

图1
图1。从牛的肝脏蛋白质匀浆分开使用GELFREE分馏系统 ,6μL每150μL的分数被加载和运行上的一维SDS PAGE凝胶电泳和银染。还装载了一个分子量(MW)的标准表示。请点击这里看到图1的放大版本。

Discussion

GELFREE 8100分馏系统,提供了一种快速,复杂的蛋白质样品分割成离散分子量为基础的分数简单,重复性好方法。这新颖的分馏方法,消除了乐队或现场切割的需要,有可能孤立广泛的群众范围,在90分钟内的蛋白质。负载能力相对大量的样品和恢复液相分数,这是典型的更难以察觉的低丰度蛋白质的分离和分析,特别是在有用的。由此产生的分数可以被用来在广泛的应用,如LC - MS的MALDI - TOF和免疫印迹。

References

  1. Tran, J. C., Doucette, A. A. Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry. Anal Chem.. (2009).
液相恢复GELFREE 8100分馏系统使用基于分子量分馏
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Cite this Article

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).More

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).

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