Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Met behulp van de GELFREE 8100 Fractionering System for Molecular Weight-Based Fractionering met Liquid Phase Recovery

doi: 10.3791/1842 Published: December 3, 2009

Summary

De bijhorende video beschrijft het gebruik van de GELFREE 8100 Fractionation System, welke partities complex eiwit monsters op basis van moleculair gewicht en herstelt de fracties in de vloeibare fase. De video beschrijft hoe de technologie werkt, hoe het wordt gebruikt, en biedt resulterende data, met polyacrylamidegelelektroforese analyse van gefractioneerde runderen leverhomogenaat.

Abstract

De GELFREE 8100 Fractioneren System is een nieuw eiwit fractionering systeem ontworpen om eiwitten herstel te maximaliseren tijdens moleculair gewicht op basis van fractionering. Het systeem bestaat uit eenmalig gebruik, 8-sample capacity cartridges en een benchtop GELFREE Fractionering Instrument. Tijdens de scheiding, is een constante spanning tussen de anode en kathode reservoirs, en elk eiwit mengsel wordt elektroforetisch aangestuurd vanuit een laadruimte in een speciaal ontworpen gel column gel. Eiwitten zijn geconcentreerd in een strakke band in een gel stapelen, en gescheiden op basis van hun respectieve elektroforetische mobiliteiten in het oplossen van een gel. Zoals eiwitten elueren uit de kolom, worden ze gevangen en geconcentreerd in de vloeibare fase in de collectie kamer, vrij van de gel. Het instrument wordt dan gepauzeerd op specifieke tijdstippen, en de fracties worden verzameld met behulp van een pipet. Dit proces wordt herhaald totdat alle gewenste fracties werden verzameld. Als er minder dan 8 monsters worden uitgevoerd op een cartridge, kan elke ongebruikte kamers worden gebruikt in latere scheidingen.

Deze nieuwe technologie maakt het snel en eenvoudig scheiding van maximaal 8 complexe eiwitmengsels tegelijk, en biedt een aantal voordelen ten opzichte van eerder beschikbaar fractionering methoden. Dit systeem is in staat het fractioneren van maximaal 1 mg van het totaal eiwit per kanaal, voor een totaal van 8 mg per cartridge. Intacte eiwitten over een breed scala massa worden gescheiden op basis van moleculair gewicht, met behoud van belangrijke fysisch-chemische eigenschappen van de analyt. De vloeibare fase entrapment zorgt voor een hoge herstel, terwijl het elimineren van de noodzaak voor band of ter plekke snijden, waardoor het fractioneringsproces zeer reproduceerbare 1.

Protocol

1. Voorbeeld eiwitpreparaat

  1. In een 500 pi microfugebuis, combineren de volgende:
Reagens Volume toe te voegen:
* Eiwit monster (tot 1 mg) Tot 112 uL
Sample Buffer (5x), voorzien in cartridge kit 30 pi
DTT 1M 8μL
18 Ω H 2 O x pi tot een totaal van monstervolume van 150μL **
  1. Denatureren de monsters bij 95 ° C gedurende 5 minuten. Afkoelen tot kamertemperatuur.

* De totale hoeveelheid eiwit te scheiden zal afhangen van de complexiteit van het monster. Voor meer complexe monsters, zoals weefsel homogenaat, is 150-200 microgram per kanaal aan te bevelen.

** Als het monster volume is minder dan 112 uL, voeg 18 Ω H 2 O tot het uiteindelijke volume van 150 ul te brengen.

2. Het laden van de GELFREE Cartridge

  1. Verwijder de GELFREE 8100 cartridge uit de folie zakje.
  2. Verwijder de plaat sealer.
  3. Verwijder de opslag buffer van de cartridge compartimenten met behulp van een pipet. Als alle acht kamers van de cartridge wordt gebruikt, kan de cartridge worden omgekeerd om de opslagbuffer afvoer van de compartimenten.
  4. Bereid de cartridge voor het laden door het toevoegen van GELFREE Running Buffer naar elk van de patroonkamers als volgt:
GELFREE Cartridge Kamer Volume van GELFREE Running Buffer toe te voegen
Anode bufferreservoir 8 ml
Kathode bufferreservoir 6 mL
Verzameling kamers 100 pi elk
  1. Verwijder en gooi eventuele buffer uit de steekproef laadruimte.
  2. Laad de 150 il monsters in de laad-kamers met gebruik van een 8-kanaals pipet.
  3. Plaats de geladen patroon in het GELFREE 8100 Fractionering Station. Laat de elektrode arrays en sluit het deksel.

3. Uitvoeren van de cartridge

  1. Met behulp van aanraking van het instrument s-scherm weer te geven, drukt u op de methode-knop om de lijst met voorgeprogrammeerde methoden te bekijken. Elk van de voorgeprogrammeerde methoden bestaat uit set spanningen en time-based pauzes ontworpen om eiwitten binnen een bepaald bereik van moleculaire gewichten op te lossen. De GELFREE 8100 zal automatisch pauzeren fractie collectie van het interval bij de methode.
  2. Zodra de juiste methode is geïdentificeerd, druk op de knop op te halen, en voer het nummer van de gewenste voorgeprogrammeerde methode met behulp van het on-screen toetsenbord. Druk op OK en druk op de knop Toepassen. De methode die is toegepast zal verschijnen aan de onderkant van het hoofdscherm.
  3. Het selecteren van de kanalen (aantal monsters), die zal worden gebruikt in de aanloop, drukt u op het kanaal knop op het hoofdscherm. Als u alle acht kanalen, drukt u op Alles selecteren. Druk vervolgens op gedaan om terug te keren naar het hoofdscherm.
  4. Zorg ervoor dat de veiligheid deksel gesloten is en dat het lampje groen is aan de onderkant van het scherm.
  5. Om te beginnen het eiwit scheiden, druk op start. De fractionering Station zal automatisch pauzeren wanneer het tijd is om fracties Noot verzamelen:. Terwijl het systeem actief is, de kringen die in het vak aan de linkerkant van het scherm tonen de status van elk kanaal. Een groene cirkel geeft aan dat het kanaal actief is, een gele cirkel geeft aan dat het instrument heeft gepauzeerd, en een rode cirkel geeft aan dat het kanaal is mislukt. De toegepaste spanningen en stromen worden getoond aan de rechterkant van het kanaal de status van cirkels. Breuken mag alleen worden verwijderd als de status van cirkels zijn geworden geel en een tekst waarschuwing verschijnt op het scherm van het instrument is.
  6. Voor het verwijderen van breuken, opent u het deksel van het instrument en gebruik van een 8-kanaals pipet tot 150 pi van elk van de collectie kamers in te trekken.
  7. Nadat de fracties zijn verwijderd, twee keer was de collectie kamer met GELFREE Running Buffer door de toevoeging van 100 ul per kanaal en en neer te pipetteren tweemaal.
  8. Na het wassen, voeg 100uL van GELFREE Running Buffer terug in de collectie kamers, sluit het deksel en druk op de doorgaan-knop.
  9. De GELFREE 8100 zal lopen tot de volgende keer interval. De totale tijd die nog in het experiment wordt weergegeven op de rechterkant van het scherm. Om te schakelen tussen de resterende tijd, verstreken tijd, en tijd om te pauzeren, druk op de knop boven het vak weergave van de tijd.
  10. Wanneer alle van de fracties zijn collected, kunnen ze direct worden gebruikt voor verder stroomafwaarts voorbereiding, zoals iso-elektrische focussering of gel elektroforese, of voor analyse met behulp van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie of immunoaffiniteits.

4. Representatieve resultaten

Een 200 ug van runderen leverhomogenaat werd verdeeld in 12 fracties elk met behulp van de GELFREE Fractionering System. 6 pi van elke fractie werd uitgevoerd op een standaard 1D SDS PAGE gel en zilver gekleurd. Zoals weergegeven in figuur 1, het eiwit monster werd gefractioneerd in 12 verschillende fracties, verspreid over het moleculaire gewicht van 3.5kDa naar 150kDa. Een moleculaire gewicht standaard (ColorBurst, Sigma) worden ook weergegeven in de lanen 1 en 14. De gel hier getoonde benadrukt de high-recovery rate bereikt met behulp van het GELFREE 8100-systeem voor eiwit fractionering. De gel hier getoonde vertegenwoordigt 4% van het eiwit hersteld van 200 ug.

Figuur 1
Figuur 1. Eiwitten uit runderen leverhomogenaat gescheiden met behulp van het GELFREE Fractionering systeem. 6 pi van elk 150 pi fractie werd geladen en draaien op een 1D SDS-PAGE-gel en zilver gekleurd. Een moleculaire gewicht (MW) standaard werd ook geladen zoals aangegeven. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien.

Discussion

De GELFREE 8100 Fractionering System biedt een snelle, eenvoudige en reproduceerbare methode voor het partitioneren van complexe eiwitten monsters in afzonderlijke moleculaire basis van fracties. Deze nieuwe methode van fractionering elimineert de noodzaak voor band of ter plekke snijden, waardoor het mogelijk is om eiwitten te isoleren over een brede massa bereik in 90 minuten. De mogelijkheid om relatief grote hoeveelheden van het monster belasting en herstel fracties in vloeibare fase is met name nuttig in de isolatie en analyse van lage-overvloed eiwitten, die doorgaans moeilijker op te sporen. De resulterende fracties kunnen vervolgens worden gebruikt in een breed scala van toepassingen, zoals LC-MS, MALDI-TOF, en immunoblotting.

Disclosures

De auteurs van dit artikel zijn in dienst van Discovery Protein dat reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.

References

  1. Tran, J. C., Doucette, A. A. Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry. Anal Chem.. (2009).
Met behulp van de GELFREE 8100 Fractionering System for Molecular Weight-Based Fractionering met Liquid Phase Recovery
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).More

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter