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Biology

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

doi: 10.3791/1842 Published: December 3, 2009

Summary

Das dazugehörige Video wird die Verwendung der GELFREE 8100 Fraktionierung System, welche Partitionen komplexen Protein-Proben auf der Basis von Molekulargewicht und erholt sich die Fraktionen in der flüssigen Phase. Das Video beschreibt, wie die Technologie funktioniert und wie es verwendet wird, und stellt daraus resultierenden Daten mit Polyacrylamidgelelektrophorese Analyse der fraktionierten Rinder Leberhomogenat.

Abstract

Die GELFREE 8100 Fraktionierung System ist ein neuartiges Protein-Fraktionierung System entwickelt, um Protein-Rückgewinnung beim Molekulargewicht basierte Fraktionierung zu maximieren. Das System ist von Einweg-, 8-Probe-Tintenpatronen und eine Tisch-GELFREE Fraktionierung Instrument zusammen. Während der Trennung wird eine konstante Spannung zwischen Anode und Kathode Stauseen angelegt, und jeder Protein-Mischung wird elektrophoretisch aus einem Füllraum in eine speziell entwickelte Gel-Säule Gel getrieben. Proteine ​​sind in einem engen Band in einem Sammelgel konzentriert und getrennt auf der Grundlage ihrer jeweiligen elektrophoretischen Mobilitäten in einem Trenngel. Da Proteine ​​aus der Säule zu eluieren, werden sie gefangen und konzentriert in der flüssigen Phase in den Sammelraum, frei von dem Gel. Das Gerät wird dann in bestimmten Zeitabständen unterbrochen, und die Fraktionen werden gesammelt mit einer Pipette. Dieser Vorgang wird solange wiederholt, bis alle gewünschten Fraktionen gesammelt wurden. Wenn weniger als 8 Proben auf einer Kassette ausgeführt werden, können Sie unbenutzte Kammern in späteren Trennungen verwendet werden.

Diese neuartige Technologie ermöglicht die schnelle und einfache Trennung von bis zu 8 komplexen Proteingemischen gleichzeitig und bietet mehrere Vorteile gegenüber bisher verfügbaren Fraktionierung Methoden verglichen. Dieses System ist in der Lage Fraktionierung bis zu 1 mg Gesamtprotein pro Kanal, also insgesamt 8 mg pro Patrone. Intakte Proteine ​​über einen weiten Massenbereich werden auf der Grundlage von Molekulargewicht aufgetrennt, Beibehaltung wichtiger physikalisch-chemischen Eigenschaften des Analyten. Die flüssige Phase Einschluss sorgt für hohe Recovery und eliminiert die Notwendigkeit für Band-oder Spot-Schneiden, so dass die Zerlegung in hohem Maße reproduzierbar 1.

Protocol

1. Beispiel Protein Preparation

  1. In einem 500 ul Mikrozentrifugenröhrchen, kombinieren Sie die folgenden:
Reagens Volume hinzuzufügen:
* Protein-Probe (bis zu 1 mg) Bis zu 112 ul
Sample Buffer (5fach) in Einbausatz zur Verfügung gestellt 30 ul
DTT 1M 8μL
18 Ω H 2 O x ul auf insgesamt Probenvolumen von 150 &mgr; l **
  1. Denaturieren die Proben bei 95 ° C für 5 Minuten. Auf Raumtemperatur abkühlen.

* Die Gesamtmenge an Protein zu trennen sein wird von der Komplexität der Probe ab. Für komplexere Proben, wie Gewebehomogenat, ist 150-200 g pro Kanal empfohlen.

** Wenn das Probenvolumen weniger als 112 ul ist, hinzufügen seit 18 Ω H 2 O zu einem Endvolumen von 150 ul zu bringen.

2. Lädt die GELFREE Cartridge

  1. Entfernen Sie die GELFREE 8100 Cartridge aus dem Folienbeutel.
  2. Entfernen und Entsorgen der Abklebefolie.
  3. Entfernen Sie die Speicher-Puffer aus der Kartusche Fächer mit einer Pipette. Wenn alle 8 Kammern der Kartusche verwendet wird, kann die Patrone invertiert, um die Speicher-Puffer aus den Fächern abzulassen.
  4. Bereiten Sie die Patrone für das Laden, indem GELFREE Laufpuffer zu jedem der Patrone Kammern wie folgt:
GELFREE Patroneraumes Volumen der GELFREE Laufpuffer hinzufügen
Anode Pufferspeicher 8 mL
Cathode Pufferspeicher 6 mL
Sammelkammern 100 ul jeder
  1. Entfernen Sie alle Puffer aus der Probe Füllraum.
  2. Laden Sie die 150 ul Proben in die Be-Kammern mit einem 8-Kanal-Pipette.
  3. Legen Sie das geladene Patrone in den GELFREE 8100 Fraktionierung Station. Senken Sie die Elektroden-Arrays und den Deckel schließen.

3. Laufen Sie die Patrone

  1. Mit dem Instrument s-Touchscreen-Display, drücken Sie die Methode, um die Liste der vorprogrammierten Methoden zu sehen. Jeder der vorprogrammierten Methoden besteht aus festgelegten Spannungen und zeitbasierte Pausen entwickelt, um Proteine ​​in einem bestimmten Bereich von Molekulargewichten zu lösen. Die GELFREE 8100 wird automatisch Pause für Fraktionssammlung in den Abständen in der angegebenen Methode.
  2. Sobald die geeignete Methode identifiziert worden ist, drücken Sie die Taste abrufen, und geben Sie die Nummer des gewünschten vorprogrammierten Verfahren unter Verwendung der On-Screen-Tastatur. Drücken Sie OK, drücken Sie die Schaltfläche Übernehmen. Die Methode, die angewendet hat, wird am unteren Rand des Haupt-Bildschirm.
  3. So wählen Sie die Kanäle (Anzahl der Proben), die im Vorfeld eingesetzt werden, drücken Sie die Kanal-Taste auf dem Hauptbildschirm. So wählen Sie alle acht Kanäle wählen, drücken Sie alle. Drücken Sie dann getan werden, um zum Hauptbildschirm zurückzukehren.
  4. Stellen Sie sicher, dass die Sicherheit Deckel geschlossen ist und dass die LED-Anzeige befindet sich am unteren Rand des Bildschirms grün.
  5. Zu Beginn der Protein-Trennung, den Startknopf drücken. Die Fraktionierung Station wird automatisch unterbrochen, wenn es Zeit Fraktionen Hinweis sammeln:. Während das System läuft, zeigen die Kreise in der Box auf der linken Seite des Bildschirms angezeigt den Status der einzelnen Kanäle. Ein grüner Kreis bedeutet, dass der Kanal aktiv ist, zeigt ein gelber Kreis, dass das Gerät angehalten wurde, und ein roter Kreis zeigt an, dass der Kanal ist ausgefallen. Die angelegten Spannungen und Ströme sind auf der rechten Seite des Kanals Status Kreise dargestellt. Fraktionen sollten nur entfernt, wenn der Status Kreise gedreht haben gelbe und eine Text-Alarm erscheint auf dem Instrument s Bildschirm.
  6. Zum Entfernen Fraktionen, öffnen Sie den Deckel des Gerätes und die Verwendung einer 8-Kanal Pipette zu 150 ul aus jeder der Sammelkammern zurückzutreten.
  7. Nachdem die Fraktionen entfernt worden sind, waschen Sie die Sammelkammer zweimal mit GELFREE Laufpuffer durch Zugabe von 100 ul pro Kanal und Auf-und Abpipettieren zweimal.
  8. Nach dem Waschen, fügen Sie 100 ul der GELFREE Laufpuffer zurück in die Sammlung Kammern, den Deckel schließen, und drücken Sie die Wiederaufnahme-Taste.
  9. Die GELFREE 8100 wird bis zum nächsten Zeitintervall ausgeführt werden. Die gesamte verbleibende Zeit in das Experiment auf der rechten Seite des Bildschirms gezeigt. Um zwischen verbleibende Zeit wechseln, verstrichene Zeit, und Zeit zu pausieren, drücken Sie die Taste über der Box Anzeigedauer einstellen.
  10. Sobald alle Fraktionen wurden collected, können sie sofort zur Weiterverarbeitung Vorbereitung, wie isoelektrische Fokussierung oder Gel-Elektrophorese, oder für die Analyse mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie oder Immunaffinitäts verwendet werden.

4. Repräsentative Ergebnisse

A 200 ug Rinderleber Homogenat wurde in 12 Fraktionen zu je partitioniert, mit dem GELFREE Fraktionierung System. 6 &mgr; l jeder Fraktion wurde auf einem Standard-1D-SDS-PAGE-Gel und Silber gefärbt laufen. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wurde die Proteinprobe fraktioniert in 12 verschiedene Fraktionen, überspannt den Molekulargewichtsbereich von 3.5kDa zu 150kDa. Ein Molekulargewicht-Standard (ColorBurst, Sigma) werden auch in den Spuren 1 und 14 dargestellt. Das Gel hier gezeigten Highlights der High-Recovery Rate erreicht mit dem GELFREE 8100 für Protein-Fraktionierung. Das Gel hier gezeigten stellt 4% des Proteins aus 200 ug erholt.

Abbildung 1
Abbildung 1. Proteine ​​aus Rinderleber Homogenat getrennt mit dem GELFREE Fraktionierung System. 6 &mgr; l je 150 ul Bruchteil geladen wurde und auf einem 1D-SDS-PAGE-Gel und Silber gefärbt. Ein Molekulargewicht (MW)-Standard wurde ebenfalls geladen, wie angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.

Discussion

Die GELFREE 8100 Fraktionierung System bietet eine schnelle, einfache und reproduzierbare Methode zur Partitionierung komplexer Protein-Proben in diskrete Molekulargewicht-basierte Fraktionen. Diese neuartige Methode der Fraktionierung entfällt die Notwendigkeit für Band-oder Spot-Schneiden, die es ermöglichen, Proteine ​​über einen weiten Massenbereich isolieren in 90 Minuten. Die Möglichkeit, relativ große Mengen an Proben laden und zu erholen Fraktionen in der flüssigen Phase ist besonders nützlich bei der Isolierung und Analyse von low-Fülle Proteine, die in der Regel schwieriger zu erkennen. Die erhaltenen Fraktionen können dann in eine breite Palette von Anwendungen, wie zB LC-MS, MALDI-TOF, und Immunoblot verwendet werden.

References

  1. Tran, J. C., Doucette, A. A. Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry. Anal Chem.. (2009).
Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung
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Cite this Article

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).More

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).

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