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Biology

Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

doi: 10.3791/1842 Published: December 3, 2009

Summary

Il video che accompagna descrive l'uso del Sistema di 8100 Frazionamento GELFREE, che partizioni campioni di proteine ​​complesse, sulla base del peso molecolare e recupera le frazioni in fase liquida. Il video descrive come funziona la tecnologia, come vengono utilizzati, e fornisce dati che ne risulta, con l'analisi di elettroforesi su gel di poliacrilamide frazionato omogenato di fegato bovino.

Abstract

Il sistema di frazionamento GELFREE 8100 è un nuovo sistema di frazionamento delle proteine ​​progettate per massimizzare il recupero delle proteine ​​durante il frazionamento peso molecolare basato. Il sistema è composto da monouso, 8-campione cartucce di capacità e un frazionamento da banco GELFREE strumento. Durante la separazione, una tensione costante viene applicata tra anodo e catodo serbatoi, e ogni miscela proteica è elettroforeticamente guidato da un vano di carico in un gel gel appositamente progettato colonna. Le proteine ​​sono concentrati in una fascia stretta in un gel accatastamento, e separati in base al loro rispettivo mobilità elettroforetica in un gel risolvere. Le proteine ​​eluire dalla colonna, sono intrappolati e concentrato in fase liquida nella camera di raccolta, libero del gel. Lo strumento viene poi messo in pausa a intervalli di tempo specifici, e le frazioni vengono raccolte con una pipetta. Questo processo viene ripetuto fino a quando tutte le frazioni desiderati sono stati raccolti. Se meno di 8 campioni sono eseguiti su una cartuccia, le camere a inutilizzati possono essere utilizzati in separazioni successive.

Questa nuova tecnologia consente la separazione semplice e veloce fino a 8 miscele di proteine ​​complesse contemporaneamente, e offre diversi vantaggi rispetto ai metodi di frazionamento precedentemente disponibili. Questo sistema è in grado di frazionamento fino a 1 mg di proteine ​​totali per canale, per un totale di 8 mg per cartuccia. Proteine ​​intatte su una vasta gamma di massa sono separate sulla base del peso molecolare, mantenendo importanti proprietà fisico-chimiche dell'analita. L'intrappolamento fase liquida prevede il recupero elevati, mentre eliminando la necessità di banda o taglio spot, rendendo il processo di frazionamento altamente riproducibili 1.

Protocol

1. Preparazione del campione di proteine

  1. In un tubo di 500 microlitri microcentrifuga, combinare i seguenti:
Reagente Volume di aggiungere:
* Campione di proteine ​​(fino a 1 mg) Fino a 112 microlitri
Esempio di Buffer (5X), fornito in kit di cartucce 30 microlitri
DTT 1M 8μL
18 Ω H 2 O x microlitri per un totale di volume del campione di 150μL **
  1. Denaturare i campioni a 95 ° C per 5 minuti. Raffreddare a temperatura ambiente.

* L'importo totale di proteine ​​da separare dipenderà dalla complessità del campione. Per i campioni più complessi, come il tessuto omogenato, 150-200 mcg per canale è raccomandato.

** Se il volume del campione è inferiore a 112 microlitri, aggiungere 18 Ω H 2 O per portare il volume finale a 150 microlitri.

2. Caricamento della cartuccia GELFREE

  1. Rimuovere il GELFREE 8100 cartuccia dalla confezione sigillata.
  2. Rimuovere e gettare la pellicola sigillante.
  3. Rimuovere il buffer di memoria dal scompartimenti cartuccia con una pipetta. Se tutti gli 8 camere di cartuccia sarà utilizzato, la cartuccia può essere invertita per esaurire il buffer di memorizzazione dal comparto.
  4. Preparare la cartuccia per il caricamento con l'aggiunta di GELFREE tampone di corsa a ciascuna delle camere di cartuccia come segue:
GELFREE camera di cartuccia Volume di tampone GELFREE corsa per aggiungere
Serbatoio tampone anodo 8 mL
Catodo serbatoio tampone 6 ml
Raccolta camere 100 l ciascuno
  1. Rimuovere e scartare qualsiasi tampone dalla camera di caricamento dei campioni.
  2. Caricare i 150 campioni microlitri nelle camere di carico con un 8-canali pipetta.
  3. Posizionare la cartuccia caricata nella stazione 8100 Frazionamento GELFREE. Abbassare il schiere di elettrodi e chiudere il coperchio.

3. In esecuzione della cartuccia

  1. Utilizzando lo strumento display touch s schermo, premere il pulsante metodo per visualizzare l'elenco dei metodi pre-programmati. Ciascuno dei metodi pre-programmati è composto da tensioni set e basata sul tempo pause progettato per risolvere le proteine ​​in un determinato intervallo di pesi molecolari. Il 8100 GELFREE automaticamente una pausa di raccolta delle frazioni agli intervalli specificati nel metodo.
  2. Una volta che il metodo più appropriato è stato identificato, premere il pulsante di recuperare e inserire il numero desiderato di pre-programmati con il metodo di tastiera visualizzata sullo schermo. Premere ok, quindi premere il pulsante Applica. Il metodo è stato applicato verrà visualizzato nella parte inferiore della schermata principale.
  3. Per selezionare i canali (numero di campioni) che verrà utilizzato nel lungo, premere il pulsante del canale nella schermata principale. Per selezionare tutti gli otto canali, premere selezionare tutte. Poi, premere fatto per tornare alla schermata principale.
  4. Assicurarsi che il coperchio di protezione è chiuso e che la spia è verde nella parte inferiore dello schermo.
  5. Per iniziare la separazione delle proteine, premere start. La Stazione Frazionamento automaticamente in pausa quando è il momento di raccogliere frazioni. Nota: Mentre il sistema è in esecuzione, i cerchi indicato nella casella sul lato sinistro dello schermo, raffigurano lo stato di ogni canale. Un cerchio verde indica che il canale è attivo, un cerchio giallo indica che lo strumento è in pausa, e un cerchio rosso indica che il canale non è riuscito. Le tensioni applicate e le correnti vengono visualizzati a destra dei cerchi lo status del canale. Le frazioni devono essere rimosso solo quando i cerchi di stato hanno trasformato un avviso giallo e il testo appare sullo schermo dello strumento s.
  6. Per rimuovere le frazioni, aprire il coperchio dello strumento e utilizzare una pipetta a 8 canali di ritirare 150 microlitri di ciascuna delle camere di raccolta.
  7. Una volta che le frazioni sono state rimosse, lavare la camera di raccolta GELFREE due volte con tampone di corsa con l'aggiunta di 100 l per canale e pipettando su e giù due volte.
  8. Dopo il lavaggio, aggiungere 100uL di GELFREE corsa tampone di nuovo nelle camere di raccolta, chiudere il coperchio e premere il pulsante Riprendi.
  9. Il GELFREE 8100 durerà fino l'intervallo di tempo successivo. Il tempo totale residuo nell'esperimento viene visualizzata sul lato destro dello schermo. Per passare il tempo rimanente, il tempo trascorso e il tempo per mettere in pausa, premere il pulsante sopra la finestra di visualizzazione del tempo.
  10. Una volta che tutte le frazioni sono state collected, possono essere utilizzati immediatamente per l'ulteriore preparazione a valle, come isoelettrofocalizzazione o elettroforesi su gel, o per l'analisi mediante spettrometria di massa, cromatografia liquida o immunoaffinità.

4. Rappresentante Risultati

A 200 mg di omogenato di fegato bovino è stato suddiviso in 12 frazioni ciascuno, utilizzando il sistema GELFREE frazionamento. 6 ml di ogni frazione è stato eseguito su un normale gel 1D SDS PAGE e tinto d'argento. Come mostrato nella Figura 1, il campione è stato frazionato in 12 frazioni distinte, che coprono la gamma di peso molecolare da 3.5kDa a 150kDa. Uno standard di peso molecolare (ColorBurst, Sigma) sono inoltre riportati in corsie 1 e 14. Il gel qui evidenzia l'alto tasso di recupero realizzato utilizzando il sistema GELFREE 8100 per il frazionamento delle proteine. Il gel qui rappresenta il 4% delle proteine ​​recuperato da 200 mg.

Figura 1
Figura 1. Le proteine ​​dal fegato bovino omogenato separati usando il sistema GELFREE Frazionamento. 6 ml di ogni frazione di 150 microlitri è stato caricato ed eseguito su un gel 1D SDS PAGE e tinto d'argento. Un peso molecolare (MW) di serie è stato anche caricato come indicato. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 1.

Discussion

Il sistema 8100 Frazionamento GELFREE fornisce un rapido metodo semplice e riproducibile per il partizionamento campioni di proteine ​​complesse in discreto peso molecolare a base di frazioni. Questo nuovo metodo di frazionamento elimina la necessità di banda o il taglio di macchia, rendendo possibile isolare le proteine ​​in un ampio intervallo di massa in 90 minuti. La capacità di carico di quantità relativamente elevate di campioni e di recuperare frazioni in fase liquida è particolarmente utile in isolamento e l'analisi delle proteine ​​a bassa abbondanza, che sono in genere più difficili da individuare. Le frazioni risultanti possono essere utilizzati in una vasta gamma di applicazioni, come LC-MS, MALDI-TOF, e immunoblotting.

Disclosures

Gli autori di questo articolo sono impiegati da Scoperta proteina che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

References

  1. Tran, J. C., Doucette, A. A. Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry. Anal Chem.. (2009).
Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida
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PDF DOI

Cite this Article

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).More

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).

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