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Biology

Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

doi: 10.3791/1842 Published: December 3, 2009

Summary

El video que acompaña describe el uso del sistema de fraccionamiento GELFREE 8100, las particiones que las muestras de proteínas complejas sobre la base del peso molecular y se recupera la fracción en fase líquida. El video describe cómo funciona la tecnología, cómo se utiliza, y proporciona los datos resultantes, con el análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida de homogeneizado fraccionada hígado de bovino.

Abstract

El sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 es un sistema de fraccionamiento de proteínas novedoso diseñado para maximizar la recuperación de proteínas durante el fraccionamiento en peso, basado molecular. El sistema se compone de un solo uso, de 8 muestras de cartuchos de capacidad y un Instrumento de sobremesa GELFREE fraccionamiento. Durante la separación, una tensión constante se aplica entre el ánodo y el cátodo de embalses, y cada mezcla de proteínas por electroforesis es impulsado a partir de una cámara de carga en un gel en columna de gel especialmente diseñado. Las proteínas se concentran en una banda estrecha en un gel de apilamiento, y separados en función de su movilidad electroforética respectivos en un gel de resolución. Como las proteínas se eluyen de la columna, se encuentran atrapados y se concentra en fase líquida en la cámara de recolección, sin el gel. El instrumento se detuvo en intervalos de tiempo específicos, y las fracciones se recogen con una pipeta. Este proceso se repite hasta que todas las fracciones deseadas se han recogido. Si menos de 8 muestras se realizan en un cartucho, sin usar ninguna cámara se puede utilizar en la separación posterior.

Esta nueva tecnología facilita la separación rápida y sencilla de hasta 8 mezclas complejas de proteínas simultáneamente, y ofrece varias ventajas en comparación con los métodos de fraccionamiento previamente disponibles. Este sistema es capaz de fraccionar hasta 1 mg de proteína total por canal, para un total de 8 mg por cartucho. Las proteínas intactas sobre un rango amplio de masas se separan en función del peso molecular, conservando importantes propiedades fisicoquímicas de la sustancia analizada. El atrapamiento fase líquida permite la recuperación de alta al tiempo que elimina la necesidad de una banda de corte o lugar, haciendo que el proceso de fraccionamiento altamente reproducible 1.

Protocol

1. Preparación de muestras de proteínas

  1. En un tubo de microcentrífuga 500 l, combine las siguientes:
Reactivo Volumen a añadir:
* La proteína de la muestra (hasta 1 mg) Hasta 112 l
Tampón de muestra (5 veces), siempre en el cartucho de juego 30 l
DTT 1M 8μL
18 Ω H 2 O l x a un total de volumen de muestra de 150μL **
  1. Desnaturalizar las muestras a 95 ° C durante 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente.

* La cantidad total de proteínas que ha separado dependerá de la complejidad de la muestra. Para muestras más complejas, tales como tejido homogeneizado, 150-200 mg por canal se recomienda.

** Si el volumen de la muestra es inferior a 112 l, agregar 18 Ω H 2 O para llevar el volumen final de 150 mL.

2. Carga del cartucho GELFREE

  1. Retire el cartucho de GELFREE 8100 de la bolsa de aluminio.
  2. Retire y deseche el papel sellador del plato.
  3. Quitar el tampón de almacenamiento de los compartimentos del cartucho con una pipeta. Si los 8 cámaras del cartucho se utiliza, el cartucho puede ser invertida para drenar el buffer de almacenamiento de los compartimentos.
  4. Prepare el cartucho para la carga mediante la adición de buffer GELFREE ejecución de cada una de las cámaras de cartucho de la siguiente manera:
GELFREE Cartucho Cámara Volumen de Buffer GELFREE Running añadir
Depósito tampón anódico 8 ml
Cátodo tanque de regulación 6 mL
Colección de cámaras 100 L cada uno
  1. Retire y deseche cualquier buffer de la cámara de carga de la muestra.
  2. Cargar las 150 muestras l en las cámaras de carga mediante una pipeta de 8 canales.
  3. Coloque el cartucho cargado en la estación de Fraccionamiento GELFREE 8100. Baje la matrices de electrodos y cierre la tapa.

3. La ejecución del cartucho

  1. Usando la pantalla del instrumento s de la pantalla táctil, pulse el botón método para ver la lista de métodos preprogramados. Cada uno de los métodos pre-programados consiste en establecer las tensiones y las pausas en función del tiempo destinado a resolver las proteínas dentro de un rango específico de pesos moleculares. El 8100 GELFREE automáticamente una pausa para la recogida de fracción en los intervalos especificados en el método.
  2. Una vez que el método apropiado ha sido identificado, presione el botón de recuperar, e introduzca el número deseado de la pre-programados método mediante el teclado en pantalla. Pulse Aceptar y luego pulse el botón Aplicar. El método que se ha aplicado en la parte inferior de la pantalla principal.
  3. Para seleccionar los canales (número de muestras) que se utilizarán en la ejecución, presione el botón del canal en la pantalla principal. Para seleccionar los ocho canales, pulse Seleccionar todo. A continuación, pulse Listo para volver a la pantalla principal.
  4. Asegúrese de que la tapa está cerrada y la seguridad de que el indicador es de color verde en la parte inferior de la pantalla.
  5. Para comenzar la separación de proteínas, pulse Iniciar. La estación de fraccionamiento se detendrá automáticamente cuando sea el momento de recoger las fracciones. Nota: Aunque el sistema está funcionando, los círculos se muestra en el cuadro en la parte izquierda de la pantalla muestran el estado de cada canal. Un círculo verde indica que el canal está activo, un círculo amarillo indica que el instrumento se ha detenido, y un círculo rojo indica que el canal ha fallado. Las tensiones aplicadas y las corrientes se muestran a la derecha de los círculos de estado del canal. Fracciones sólo deben ser retirados cuando el estado de los círculos se han vuelto de color amarillo y una alerta de texto en la pantalla del instrumento s.
  6. Para eliminar las fracciones, abra la tapa del instrumento y el uso de una pipeta de 8 canales para retirar 150 l de cada una de las cámaras de colección.
  7. Una vez que las fracciones se han retirado, lavar la cámara de recolección dos veces con tampón GELFREE Correr por la adición de 100 l por canal y pipeteando arriba y abajo dos veces.
  8. Después del lavado, añadir 100uL de GELFREE funcionamiento de amortiguación de nuevo en las cámaras de recolección, cierre la tapa y pulse el botón Reanudar.
  9. El GELFREE 8100 se extenderá hasta el siguiente intervalo de tiempo. El tiempo total que queda en el experimento se muestra en la parte derecha de la pantalla. Para alternar entre el tiempo restante, el tiempo transcurrido y el tiempo para hacer una pausa, pulse el botón encima de la caja que muestra la hora.
  10. Una vez que todas las fracciones se han collected, inmediatamente se puede utilizar para la preparación de más abajo, tales como el isoelectroenfoque y electroforesis en gel, o para el análisis mediante espectrometría de masas cromatografía líquida o de inmunoafinidad.

4. Resultados representante

A 200 mg de homogenado de hígado de bovino fue dividida en 12 fracciones cada uno, utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE. 6 l de cada fracción se ejecutan en un gel PAGE 1D SDS y tinción de plata. Como se muestra en la Figura 1, la muestra de proteína se fraccionó en 12 fracciones distintas, que abarcan el rango de peso molecular de 3.5kDa a 150kDa. Un estándar de peso molecular (ColorBurst, Sigma) se muestran también en las calles 1 y 14. El gel se muestra aquí destaca el elevado índice de recuperación de lograr mediante el sistema de GELFREE 8100 para el fraccionamiento de proteínas. El gel se muestra aquí representa el 4% de la proteína recuperada a partir de 200 mg.

Figura 1
Figura 1. Proteínas a partir de hígado de bovino homogenado separado utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE. 6 l de cada fracción de 150 l se carga y se ejecuta en un gel PAGE 1D SDS y tinción de plata. Un peso molecular (MW) estándar se ha cargado también, como se indica. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 1.

Discussion

El sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 proporciona un método rápido, simple y reproducible para la partición de muestras complejas de proteínas en función del peso molecular fracciones discretas. Este nuevo método de fraccionamiento elimina la necesidad de la banda o el corte in situ, por lo que es posible aislar las proteínas en un rango amplio de masas en 90 minutos. La capacidad de carga de cantidades relativamente grandes de la muestra y se recuperan las fracciones en la fase líquida es particularmente útil en el aislamiento y el análisis de proteínas de baja abundancia, que suelen ser más difíciles de detectar. Las fracciones resultantes se pueden utilizar en una amplia gama de aplicaciones, tales como LC-MS, MALDI-TOF, y la inmunotransferencia.

References

  1. Tran, J. C., Doucette, A. A. Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry. Anal Chem.. (2009).
Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida
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Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).More

Witkowski, C., Harkins, J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. J. Vis. Exp. (34), e1842, doi:10.3791/1842 (2009).

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