Multieletrodo Recordings Matriz do Epitélio Vomeronasal

Summary

Multieletrodo array (MEA) gravações de fornecer um método para o estudo da atividade elétrica de grandes populações de neurônios. Aqui, apresentamos os detalhes de uma preparação MEA para gravar a partir do epitélio do mouse vomeronasal, ao mesmo tempo estimulando o tecido.

Abstract

Compreender os circuitos neurais requer métodos para gravar a partir de muitos neurônios simultaneamente. Para

Protocol

Parte 1. Instrumentação gravação elétrica

1. Nós usamos uma variedade multieletrodo planar (Instrumentos Científicos ALA) com 10 mM de eletrodos planos de titânio isolado com nitreto nitreto de silício. 60 eletrodos são dispostos em dois campos que consiste em uma grade 5x6 com o centro a centro-espaçamento de 30 mm. (Outras configurações também são possíveis; eletrodos com uma superfície de gravação de 10 m de diâmetro são melhores do que os eletrodos maior em termos de isolar a atividade de neurônios individuais.)
2. Sinais elétricos são amplificados (amplificação 1000x), utilizando um MEA 1060 amplificador (ALA Scientific Instruments). Sinais são adquiridos em 10 kHz usando um cartão de aquisição de dados (National Instruments) e software de aquisição de dados personalizados (também pode comprar um software comercial).
3. O tecido é pressionada sobre o MEA por uma malha de nylon (53 mm), que é ligado a um acessório personalizado que se encaixa perfeitamente dentro do anel tubo de cultura do MEA.

Parte 2. Instrumentação Entrega líquido

1. O tecido requer superfusão contínua, o que nós garantimos, fornecendo solução de Ringer (115 cloreto de sódio mM, 5 mM cloreto de potássio, 2 cloreto de cálcio mM, 2 de cloreto de magnésio mM, 25 de bicarbonato de sódio mM, 10 HEPES mM e 10 mM D-(+ ) glicose) de uma bomba de HPLC. Estímulos são apresentados através da realização de injeções em uma válvula de HPLC e alternar entre flow-through eo loop. Tanto a bomba HPLC e bomba de injeção é o robô seringa são fornecidos com solução de Ringer.
2. Solução de Ringer é mantido em um banho de água aquecida (ISOTEMP 105) a 42 ° C durante todo o experimento e é continuamente aeradas com 95% O ₂ / 5% CO _2. Um frasco separado de Ringer sem glicose está preparado para suportar a bomba de seringa. Solução de Ringer é entregue para o tecido usando um 307 HPLC bomba (Gilson) a uma taxa de 3 mL / min. Em um experimento típico horas 5-6, 1 L de solução de Ringer com cada é suficiente.
3. Durante todo o experimento, o tecido é continuamente superfused com 37 ° C solução Ringer. Uma sonda de aquecimento está posicionado diretamente acima do tecido.
4. Estímulos são entregues usando o Gilson 215 braço manipulador robótico líquido. Estímulos são armazenados em frascos de borracha-capped de vidro, e sob o controle de software Gilson, o braço robótico fornece os estímulos à linha de perfusão enquanto a taxa de fluxo constante e pressão são mantidas.
5. O estado da válvula de HPLC (loop engajados / envolvidos não) é representado por uma tensão elétrica, que é gravada pelo computador de aquisição como um canal extra para garantir a sincronização com a atividade neuronal.

Parte 3. Preparando o MEA e estímulo dispositivo de entrega

1. Antes de realizar a dissecção, preencher o MEA bem com BSA em dH2O por pelo menos 5 minutos em temperatura ambiente.
2. Lavar a MEA usando warm-bolhas de solução de Ringer e coloque o MEA no gelo.
3. Primeiro o manipulador de líquido e HPLC bomba de acordo com instruções do fabricante.

Parte 4. Dissecação VNO

1. Antes de realizar a dissecção, preencher dois pratos 60x15 milímetros de Petri com solução de Ringer com bolhas e colocar no gelo. Também preencher 2 Sylgard pratos Petri revestidas do mesmo tamanho com solução de Ringer e colocar no gelo. Frio um adicional de 50 mL warm-bolhas de Ringer para uso durante a dissecção.
2. O mouse é sacrificado através CO ₂ seguido asfixia por deslocamento cervical.
3. Fazer incisões bilaterais a partir do lado da boca, correndo paralela à linha da mandíbula, a parte de trás da cabeça. Junte-se a dois cortes ao longo da parte de trás do pescoço e remover a parte dorsal da cabeça, deixando o maxilar inferior ligados ao mouse.
4. Com uma tesoura fina, corte entre o tecido e ambos os lados do osso maxilar superior para separar o tecido do osso.
5. # 3 Usando uma pinça, retire o tecido do palato para expor a cavidade nasal.
6. Com uma tesoura pequena ou um bisturi, cortar entre e em ambos os lados da parte superior dois dentes da frente para libertar a cápsula vomeronasal do osso.
7. # 3 Usando uma pinça, pegar a cápsula vomeronasal pelo osso plana e coloque na placa de Petri sobre gelo. Os passos para cima através de imersão deve ser realizada em menos de 3 minutos.
8. Coloque o prato sob microscópio estereoscópico, iluminado com a luz refletida. Remova a cápsula óssea de um VNO em um tempo usando # 3 fórceps. Use um lado para estabilizar a cápsula óssea segurando a partir do final caudal ea outra mão para descascar o osso longe do VNO, tomando cuidado para não danificar o VNO.
9. Quando o osso é removido, a transferência do VNO a uma placa de Petri Sylgard revestido. Use o prato restantes para o VNO outros. Mudar a iluminação de luz transmitida.
10. Usando micro-tesouras ou pinças # 5, separar o VNO do vaso sanguíneo cortando ao longo da borda do VNO. Neste ponto, você vaitêm a folha neural completamente separada do vaso sangüíneo.
11. Coloque o VNO com o lado interno (dendríticas). # 3 Usando fórceps, âncora do VNO ao Sylgard em um canto do tecido. Descasque o epitélio neural da lâmina basal através de um pequeno fragmento de uma lâmina de barbear revestidas de Teflon realizada com uma pinça. Segurando a lâmina em um ângulo raso (<30 ° da superfície da placa) é melhor.
12. Com uma pipeta de vidro, transferir o pedaço de epitélio neural do prato para o MEA. Posição do VNO em cima do campo eletrodo com o lado dendríticas up. Retire o excesso de solução de Ringer com uma pipeta. Coloque o suporte de tecido mesh para o bem da matriz para manter o VNO no lugar, e encha com solução de Ringer resfriada é.

Parte 5. Gravação

1. Coloque o MEA em 1060 MEA amplificador e posição da sonda aquecedor diretamente acima do tecido.
2. Para confirmar a colocação da sonda adequada aquecedor, estimular com solução de Ringer contendo 50 mM de potássio (substituído por sódio equimolar) por 2 segundos. Ajuste de posicionamento para minimizar a latência da resposta neural para a solução de potássio.
3. Superfuse o tecido com uma solução de Ringer aquecido por 45 minutos a 1 hora antes da gravação para permitir que o tecido se adapte.
4. Sinais elétricos são salvos no disco usando o software de gravação personalizada.

Parte 6. Análise de Dados

1. Análise de dados offline pode ser feito usando as gravações eletrodo-primas. Por exemplo, podemos medir a alterações na taxa de disparo das células gravadas em resposta a ligantes particular. Os conjuntos de dados resultantes são grandes e podem ser utilizados para tratar várias questões diferentes; familiaridade com uma linguagem de programação ou análise (C, Matlab, R, Python, ou similar) é necessária.

Parte 7. Resultados representante

Esta preparação é tipicamente estável o suficiente para gravar a partir de 6 horas, produzindo uma grande quantidade de dados (6 horas de gravação de 60 eletrodos).

Figura 1. Um instantâneo da atividade simultânea em toda a metade da matriz é mostrado. A janela de tempo se estende por 400 ms. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.

Figura 2. Em um experimento típico, estimulamos com compostos de interesse particular por 10 segundos. Este traço é um exemplo de uma resposta a 100 vezes urina do rato diluída feminino. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 2.

Discussion

Gravações série multieletrodo permitem-nos a capacidade de monitorar a atividade simultânea de uma grande população de neurônios. Esta é uma ferramenta útil para investigar as propriedades de um sistema sensorial, especificamente o VNO. Ao contrário do sistema olfatório, o VNO detecta estímulos em fase líquida. Além disso, o VNO é um tecido heterogêneo. Existem aproximadamente 300 tipos diferentes de receptores no mouse ^1, presumivelmente com perfis de resposta diferentes. Gravações MEA combinado com o braço robótico permitem-nos de forma confiável entregar estímulos líquido para uma população grande e diversificada de neurônios e identidade de uma resposta eletrofisiologicamente. Além disso, a estabilidade do VNO in vitro permite tempo para múltiplas repetições de um estímulo.

Anteriormente, esta técnica tem sido utilizada para investigar as propriedades sensoriais do VSNs em resposta a urina do rato ^2, bem como servir como um ensaio confiável para a identificação de ligantes individuais presentes na urina ^3. No futuro, esta técnica pode ser muito útil para a descoberta de novos ligantes e na caracterização das propriedades sensoriais do VNO.