Summary
تقييم ثنائي الأبعاد المحاكمات التبلور (2D) لتشكيل المصفوفات أمرت بروتين الغشاء هو مهمة حرجة وصعبة للغاية في البلورات الإلكترون. نحن هنا وصف نهجنا في الكشف عن وتحديد 2D بلورات صغيرة من بروتينات غشاء الغالب في نطاق 15 -- 90kDa.
Abstract
وقد تطورت الإلكترون البلورات كوسيلة التي يمكن استخدامها كبديل أو بالاشتراك مع ثلاثي الأبعاد وبلورة البلورات بالأشعة السينية لدراسة بنية وظيفة أسئلة للبروتينات الغشاء ، فضلا عن البروتينات القابلة للذوبان. الكشف عن بلورات (2D) ثنائي الأبعاد بواسطة المجهر الإلكتروني انتقال (EM) هي خطوة حاسمة في إيجاد ، والأمثل ، واختيار العينات لجمع بيانات عالية الدقة عن طريق البرد EM. نحن هنا وصف الخطوات الأساسية في تحديد كل كبيرة وأمر ، وكذلك المصفوفات 2D الصغيرة ، التي يمكن أن العرض المعلومات قد تكون حاسمة لتحسين ظروف التبلور.
من خلال العمل مع تكبير مختلفة في طب الطوارئ ، يتم الحصول على بيانات عن مجموعة من المعلمات حرجة. انخفاض امدادات التكبير بيانات قيمة عن حجم التشكل والأغشية. في أعلى تكبيرا ، ويتم تحديد أبعاد ممكن الكريستال النظام و2D. في هذا السياق ، هو وصفها كيف تستخدم الكاميرات لاتفاقية مكافحة التصحر على الإنترنت ، ويتحول فورييه في أعلى تكبيرا لتقييم proteoliposomes عن النظام والحجم.
بينما هي الأكثر شيوعا نمت بلورات 2D للبروتينات غشاء التي كتبها إعادة غسيل الكلى ، وتقنية فحص ينطبق أيضا على بلورات أنتجت بمساعدة monolayers ، 2D الكريستال الأصلي ، وأمرت صفائف من البروتينات القابلة للذوبان. قد بالإضافة إلى ذلك ، الأساليب المذكورة هنا تنطبق على الكشف عن بلورات 2D من أصغر وكذلك بروتينات غشاء أكبر ، حيث أصغر البروتينات تتطلب نفس القدر من العناية في تحديد كأمثلة لدينا وشعرية وأكبر من البروتينات يمكن التعرف بسهولة أكبر في المراحل الأولى من الفرز.
Protocol
1. إعداد شبكة من المحاكمات البلورة 2D
- مستعدون الكربون المغلفة 400 شبكة النحاس EM الشبكات التي صمة سلبية. وكثيرا ما يستخدم خلات اليورانيل ، ويوفر وصمة طويلة الأمد في مجال التخزين من الحل لعدة أشهر قبل الاستخدام ، فضلا عن صلاحيتها للتخزين الطويل الأجل للشبكات. في المقابل ، البقع السلبية الأخرى مثل فورمات اليورانيل ، مع توفير تلطيخ ممتازة ، ويجب القيام بها حديثا 1. للتحضير السريع لعدد كبير من الشبكات التي تستخدم لفحص التجارب تبلور 2D ، يتم استخدام نسخة معدلة من تلطيخ السلبية. هو وحدة تخزين pipetted من 2 ميكرولتر من العينة على الكربون المغطاة بالشبكة EM والمحتضنة لمدة 60 ثانية. اعقب ذلك من على حافة النشاف مع قطعة ممزقة Whatman # رقة الترشيح 4 (الشكل 1 ؛ الفيديو) ، ومن ثم يتم تطبيقها 2 ميكرولتر من خلات اليورانيل 1 ٪ على الفور ، ومرة أخرى الذي نشف من على حافة الشبكة بعد 30 س. لمس الشبكة على حافة الحافة مع ممزقة ورقة الترشيح يضمن إزالة الأمثل للسيولة دون إزالة proteoliposomes. وعلاوة على ذلك ، والتجفيف على حافة الشبكة يضمن الحفاظ على تحسين الفيلم الكربون. يجب توخي الحذر في إعداد والتعامل مع الشبكات ، وكسر للفيلم الكربون الدقيقة يمنع التصاق العينة ، ويمكن أن يؤدي إلى تمثيل غير دقيق من العينة. في حين أن حجم عينة أكبر من 5 ميكرولتر تقليديا كانت ولا تزال تستخدم بشكل روتيني لإعداد الشبكة ، يمكن حفظ العينات الثمينة عن طريق تخفيض حجم ميكرولتر إلى 2 أو أقل من 2.
- لإنتاج أكبر الأغشية ممكن ، لدينا بعض العينات تتطلب تركيزات عالية من الجلسرين أو السكروز (10-20 ٪) لتكون موجودة في المخزن المؤقت لغسيل الكلى. وهذا يمكن أن يكون لها تأثير سلبي على إعداد الشبكة ، كما الجلسرين أو السكروز هو لزج جدا ويمنع خلات اليورانيل من اختراق المنطقة العازلة بشكل صحيح ، وبالتالي غير كامل تلطيخ الأغشية. وبالتالي سوف يكون غامضا شعرية ممكن. يمكن غسلها إما يمكن تبادل عازلة بواسطة الطرد المركزي من العينات والاستعاضة عنها الجلسرين / السكروز خالية العازلة (لا يظهر) ، أو مع شبكات في المخزن أو الجلسرين / السكروز خالية عازلة في واحد لعدة دورات قبل سلبية مماثلة لتلطيخ وهي تقنية تستخدم لالبرد EM 3،4.
2. تقييم المحاكمات البلورة 2D بواسطة EM
- اعتمادا على نوع من صاحب العينة ، يتم تحميل أي واحدة أو عدة شبكات. والتكبير من 10K - 2 ، والتي ستكون على النحو المشار إليه هنا التكبير وسيطة ، ويسمح للانطباع الأول من توزيع متوسط ومدى تشتت الأغشية ، والتشكل ، والحجم ، والتي أخذت علما في دفتر مختبر 5. وتسجل المناطق المناسبة لمحات عامة وممثل بمساعدة كاميرا CCD ، أو إذا كاميرا CCD غير متوفر ، على الفيلم.
- يستخدم التكبير منخفضة في نطاق 800x - 400 تقريبا في أوقات هو المطلوب لمحة عامة عن نموذج كامل / الشبكة. بينما لا يعمل مع كل الشبكة ، والتكبير المنخفض يعطي معلومات قيمة للمساعدة في تقييم إعداد الشبكة من حيث عدة جوانب : كلا تلطيخ السلبية المحتملة والكسر الجزئي للفيلم الكربون ، وتركيز العينة على الشبكة ، والتوزيع غير المتكافئ proteoliposome ربما. يمكن اعتبار شبكة الساحات الفردية مع مناظير أو كاميرا CCD. مع بعض EMS فمن الممكن لانقاذ مناصب ذات أهمية خاصة ، والتي يمكن التذكير للتفتيش في وقت لاحق في أعلى تكبير.
- مرة واحدة وقد تم تحديد منطقة الشبكة من الفائدة عند التكبير إما منخفضة أو متوسطة ، يتم تغيير التكبير إلى 60K - 50K تقريبا. اعتمادا على الكريستال ، وغشاء الخلية وحدة الحجم ، إذا كانت معروفة ، كما تكبير منخفضة وعالية 30K 80K كما يتم استخدامها. وسيتم إحالة مجموعة من التكبير 80K - 30 إلى أنه التكبير عالية لغرض الكشف عن بلورات 2D. تركز يحدث إما في وضع التركيز على تعيين ما يصل جرعة منخفضة ، مع تبديل لاحقة لصورة / صور الإعداد ، أو في المنطقة المجاورة لمنطقة الفائدة.
- في حالات من الغموض في ما إذا كان مجال اهتمام حقا الغشاء ، ويتم تفتيش نموذج للفيلم الكربون في حجم proteoliposomes ، والميكا ، أو الأعمال الفنية الأخرى. لهذا الغرض ، تكشف عن حواف نموذجية قابلة للطي والتشكل.
- الآن يتم تفتيش المنطقة في المصالح مع كاميرا CCD. ويتم جمع صورة اتفاقية مكافحة التصحر في 30K - 80K التكبير ، اعتمادا على حجم الغشاء والبروتين أو وحدة حجم الخلية ، أو يعرف المنطقة البلورية. المشبك من بروتين الغشاء أصغر و / أو مسعور معظمها غير مرئية بالضرورة التقييم البصري للصورة CCD نفسها. إما أن تستخدم الصورة بأكملها لتحويل الانترنت فورييه (FT ، أو سريع FT FFT). هذا وسوف FT تحتوي على كمية كبيرة من الضوضاء ، ولكن ، إذا كان صفيف أمر صغير. وبالتالي ، فإن انخفاض حجم الصورة محاصر تسمح لنسبة الإشارة إلى الضوضاء لتحسين األصغرلير الكريستال وسهولة تحديد الهوية. لهذا الغرض ، يتم نقل مربع فوق الصورة وقيمت FT حية.
يتم ضبط كثافة / سطوع شعاع حفظ جرعة منخفضة من الشروط اللازمة لعينة ، وكذلك إعدادات الكاميرا CCD في الاعتبار. تبعا لكاميرا CCD المستخدمة ، ويتم ضبط غاما من FT العيش لتحديد الأمثل للصفائف أمر. يمكن لقيمة عالية بشكل مفرط غامضة البقع نتيجة للتبرعات من الضوضاء ، وقيمة غاما منخفضة بشكل مفرط سيمنع أضعف من أن البقع التي تم تحديدها. قد تكون هذه البقع الأضعف بسبب صفائف البلورية مع بقع صغيرة في FT بالكاد فوق مستوى الضجيج.
في حين تم جمع البيانات على دقة أعلى من عدد صغير من العينات 6 ، ويقتصر عادة على قرار من بلورات 2D ملطخة سلبا أو لا ينبغي أن يكون من المتوقع أن يكون أفضل من القرار 15A تقريبا. مع ما يقرب من يزيل التباؤر -400 نانومتر ، وليس من المتوقع أن أكثر من 1-3 أوامر من المواقع ليتم التعرف بسهولة. عادة لا يتم تقييم عينات لتحليل ، والبرد EM جمع البيانات سوف تعطي مؤشرا والسليم للقرار أعلى يمكن تحقيقه. ويلاحظ من الحدة البقع وعلى الرغم من mosaicity ممكن.
- يتم تقييم الأغشية المختلفة ، فضلا عن morphologies الغشاء ، لأجل في التكبير عالية. هذا أمر بالغ الأهمية ولا سيما في بداية مراحل وسيطة أو المحاكمات تبلور 2D ، كما proteoliposomes أصغر بدلا من بقع أكبر أو الغشاء يمكن أن تحتوي على أكثر المناطق الواعدة. ونسب منخفضة جدا من البلورات 2D تتطلب الحصول على الصور وتمويل الإرهاب ، أو الحيود الضوئي ، وجود عدد كبير من الصور الأولية لتحديد الهوية منذ صفائف أمر سوف يؤدي في كثير من الأحيان إلى تحسن سريع في حجم ونوعية 2،4،7.
3. ممثل النتائج
proteoliposomes أمر مثالي عرض يمكن التعرف عليها بسهولة ، وبقع حادة. يتم التعرف عليها بسهولة بلورات كبيرة وكذلك أمر على حدة الانترنت FT - CCD من الصور الضوئية للحيود أو micrographs.
على سبيل المثال يظهر بلورات 2D من البروتين غشاء صغير من 18kDa التي تصل إلى عدة ميكرون في الحجم. يتم التعرف عليها بسهولة البقع على قدم وحادة. الحركة من مربع الحية FT يدل على أن شعرية مستمر دون mosaicity. ويمكن تحديد شعرية من مجموعة أكبر من البروتين مع ملك للذوبان أوسع نطاقا على الشاشة الصغيرة في EM. CCD جمع الصور وFT هو ضروري لتوفير وسيلة لتقييم أفضل واكتساب معلومات عن mosaicity ، على سبيل المثال ممكن (اعرض FT). عند حساب FT لproteoliposome التي لا يمكن للأمر ، في البداية لا يمكن تمييزه عن الضوضاء البقع. بينما يتم نقل مربع لFT - العيش ، ومع ذلك ، فإن البقع تختفي. من ناحية أخرى ، المصفوفات الصغيرة ، مع crystallinity مشكوك ، وسيكون ما تبقى من بقع ثابتة عند نقل الحية FT ولو قليلا فوق منطقة الصورة. وعلاوة على ذلك ، يمكن التعرف على هذه البلورات الصغيرة عادة من خلال وجود وحدة الخلية نفسها الأحجام ، ويمكن قياس المسافات بين المواقع المختلفة في FTS بطرق مختلفة ، مثل مع دائرة من حجم معين. بلورات الدهن عرض مورفولوجيا شعرية متميزة وFT.
ليس من غير المألوف لمواجهة هطول الأمطار في التجارب الأولية. الأمطار هنا البروتين دون حاجة إلى إعادة يمكن تمييزها عن مجاميع صغيرة على الرغم من الدهون. العينات التي يبدو أن يترسب في التكبير منخفضة كثيرا ما تتحول إلى أن تكون المجاميع الدهون عند عرضها في أعلى التكبير. عند تفتيش في 50K - 30 ، حواف هذه الهياكل المظلمة تكشف أن يتألف منهم من الأغشية مع عدم وجود ترسب البروتين. هذه الملاحظات الهامة التي قد تكون زيادة الدهون في حجم الركام لأغشية كبيرة في التجارب التالية.
وترتبط أحيانا سوء النتائج في عينات تقييم إلى تركيز منخفض الغشاء الذي يمنع الفرز السليم والسريع. ويمكن التغلب على كثير من الأحيان يكون هذا مع استخدام التركيز العالي من البروتين لبلورة 2D بواسطة غسيل الكلى. بدلا من ذلك ، يمكن ترك الأغشية لتسوية لبضعة أيام في الجزء السفلي من الأنبوب إيبندورف أثناء التخزين. في بعض الحالات تسوية سريعة ، أو لحظة ما يقرب من الأغشية ويحدث pipetting من أسفل الأنبوب سوف يؤدي إلى ارتفاع كثافة الغشاء على الشبكة. خيار آخر هو أسرع بكثير الطرد المركزي (في 3000-8000 دورة في الدقيقة لمدة 1-3) من العينات مع العينات اللاحقة من الجزء السفلي من الأنبوب.
سوف العينات تحت الظروف المثلى تحتوي على نسبة كبيرة من البلورات 2D. ليس من الضروري لهدف لمظهر متجانس من الأغشية ، وجمع أكبر ويتم اختيار معظم بلورات 2D امر جيد بصريا للبيانات. وسوف تكون هذه الأنواع من العينات المعترف بها بسهولة عندما يتم تكرار التجارب تبلور وكذلك عندما يتم استخدام العينات لالبرد EM جمع البيانات ، مما أدى إلى أكبر عدد ممكن من الصور ذات الدقة العالية.
الشكل 1. النشاف وهذا الرقم يدل على حافة الشبكة مع قطعة ممزقة Whatman # 4 ورق الترشيح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التقييم السليم للعينات يتطلب تقييم دقيق لعدد كاف من الأغشية. على سبيل المثال ، أعطى العينات مع منخفضة تصل إلى 2 ٪ صفائف البلورية من أصل أكثر من 180 proteoliposomes تصوير المعلومات الهامة عن التحسين السريع لظروف تبلور 2D 7.
عندما ترسب البروتين يحدث ، قد يكون التخلي عن الشبكة من مزيد من الفحص بعد التفتيش عند التكبير المنخفضة ، على الرغم من هطول الأمطار جزئية عرضية من البروتين يحدث. يمكن الأغشية حتى ولو كانت صغيرة جدا من أقل من 100 نانومتر تعطي معلومات مفيدة عن النظام رغم ذلك ، ويمكن تنفيذها المعلمات إلى زيادة حجم 2D الكريستال في التجارب التالية غسيل الكلى.
المختبرات الموجودة في عملية إدخال درجات مختلفة من أتمتة واعدة في عملية الفرز 8،9. وحتى الآن لا تزال تتطلب خطوات العينات للتقييم ومعرفة حجم الكريستال 2D ، مورفولوجيا ، والنظام كما هو موضح هنا. في المستقبل ، فإنه قد يصبح من الممكن لتحليل البيانات من بلورات صغيرة 2D متزايد إلى ارتفاع القرار ، مما يجعل هذه الخطوات الفحص والتقييم أكثر صعوبة من أصغر المناطق البلورية حتى أكثر أهمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر المتعاونين لدينا لتقديم عينات من البروتين قيمة ، والتي ساهمت في بعض طرقنا من الخبرة ذات الصلة ، والملاحظات. غونتر Schmalzing قدمت تفضلت الفرصة لFR للانضمام إلى هذا المشروع. وشكرت باربرا أرمبروستر ، برينك يعقوب وديريك ميلز لمساعدتهم المعلقة ومدخلات بشأن المعدات. وقدم التمويل من المعاهد الوطنية للصحة منح HL090630.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | |||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | ||
| Micropipette and pipette tips | |||
| Whatman #4 filter paper | |||
| 1% uranyl acetate | |||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | |||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | ||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
References
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy. Methods. 41, 417-426 (2007).
- Wang, D. N., Kühlbrandt, W. High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media. J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).
- Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles. Micron. , (2010).
- Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent γ-glutamyl carboxylase. J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).
- Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 Å resolution. J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).
- Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters. J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).
- Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. Towards automated screening of two-dimensional crystals. J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).
- Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).
