Summary
形成有序的膜蛋白质阵列的二维（2D）的结晶试验评价是一个非常关键的电子晶体而艰巨的任务。在这里，我们描述了我们的方法，筛选，并确定在15范围内的主要是小膜蛋白的二维晶体 - 90kDa。
Abstract
电子晶体学已经发展成为一个可以交替使用，也可以结合三维结晶和X射线晶体学研究膜蛋白的结构与功能的问题，以及可溶性蛋白的方法。二维（2D）晶体透射电子显微镜（EM）的筛查是在寻找关键的一步，优化，并选择冷冻电镜的高分辨率数据采集的样品。在这里，我们描述了大型和排序，以及小型二维数组，可以潜在的结晶条件的优化提供重要的信息在确定的基本步骤。
通过不同放大倍数的EM，在一系列关键参数的获取数据。下放大倍率上的形态和膜大小提供了宝贵的数据。在更高的放大倍率，确定可能的秩序和二维晶体的尺寸。在这种情况下，它是描述CCD相机和在线傅立叶变换是如何在更高的放大倍率用于评估顺序和大小proteoliposomes。
虽然膜蛋白的二维晶体，是最常用的透析重建的速度增长，筛选技术也同样适用于单层，帮助本地的二维晶体生产晶体，并下令可溶性蛋白质阵列。此外，这里介绍的方法适用于二维晶体更小，以及较大的膜蛋白，其中较小的蛋白质需要在识别相同数量的护理我们的例子中，较大的蛋白质晶格的筛选，可能会更容易识别在早期阶段的筛选。
Protocol
1。电网制备二维结晶试验
- 碳包400目铜EM电网负染色准备。醋酸铀是经常使用的，并提供在存储解决方案方面的长期染色前使用，以及适合长期存储网格的几个月。相比之下，其他负面的污渍，如铀酸盐，同时提供优良的染色，需要新鲜的。对于大量的二维结晶试验筛选用于电网的快速准备，负染的修改后的版本使用。 2μL的样品量吸管将碳覆盖EM网格和孵育60秒。这是一个撕成片的Whatman＃4滤纸（图1，视频）从边缘杂交，然后2μL1％醋酸铀立即应用，这是再次涂抹后，30日从电网的边缘第在谈到与滤纸撕边的边缘电网确保不拆除的proteoliposomes最佳去除液体。此外，在电网的边缘干燥，确保改进的碳薄膜的保存。必须小心，在准备和处理电网，微妙的碳薄膜的破损防止样品的附着力，并可能导致不准确的代表性样品。虽然较大的样本量5μL传统和常规电网准备，可节省宝贵的样品量减少2μL或更少2。
- 为了产生尽可能大的膜，我们的一些样品需要透析缓冲甘油或蔗糖浓度高（10-20％）。这可能对电网准备的负面影响，如甘油或蔗糖是高度粘性和正确地渗透到缓冲区，因而不完全染色膜，防止醋酸铀。因此，一个可能的晶格会被遮蔽。可以通过离心的样品和替代甘油/蔗糖缓冲液（未显示），或电网交换缓冲区要么可水洗负染色类似与前几个周期的缓冲区或甘油/蔗糖在一个无缓冲3,4冷冻电镜采用的技术。
2。评估EM二维结晶试验
- 根据样品架类型，加载一个或多个网格。 2 - 10K，这将在这里被称为中间放大倍率的放大倍率，可以平均分配和膜，形态和大小，这是在实验室笔记本5注意到的分散程度的第一印象。适宜地区作为与CCD相机的帮助下代表概述或记录，如果CCD相机是不可用在胶片上，。
- 概述整个样本/电网需要时，使用低倍率范围在大约400 - 800X倍。虽然不是每个网格就业，低倍率提供有价值的信息的帮助，在电网准备在几个方面的评价：负染色和潜在的碳薄膜，样品的浓度，对电网和可能proteoliposome分布不均的局部破损。用双筒望远镜或CCD摄像头，可能被视为个人方格。随着一些新兴市场有可能保存特别感兴趣的职位，放大倍率越高，可稍后再检查召回。
- 一旦利益的网格区域已确定或低中间放大倍率，放大倍率约50K - 60K。根据膜，水晶和单位细胞的大小，如果知道的话，低为30K和高达80K高放大倍率的使用。放大倍率范围为30 - 80K将被称为高倍率筛选二维晶体的目的。聚焦发生在低剂量的设置焦点设置，图像/照片设定，或在感兴趣的区域附近，随后开关。
- 在感兴趣的领域是否确实是一种膜含糊不清的情况下，检查样品的碳薄膜proteoliposomes，云母，或其他文物的大小。为此，边缘显示了典型的折叠和形态。
- 现在感兴趣的领域进行检查与CCD相机。 CCD图像收集在30K - 80K放大，根据膜的大小，蛋白质或单位细胞大小，或称为结晶区。不一定是较小的和/或主要是疏水的膜蛋白的晶格可见CCD图像本身的视觉评估。整个图像要么是用于在线傅立叶变换（FT，或快速傅立叶变换FFT）。这个金融时报“将包含大量的噪音，但是，如果有序阵列。因此，减少盒装图像的大小，将允许改进的信号噪声比一个SMaL公司LER晶体，并便于识别。为此，框移到图像和现场的FT评估。
梁的强度/亮度调整，保持低剂量条件下的样品，以及心中的CCD相机设置。根据所使用的CCD摄像头，现场的FT的伽玛调整为有序阵列的最佳识别。过高的值可以掩盖斑点噪声贡献，和过低的伽玛值将防止从弱点被确定。这些较弱的斑点可能是由于较小的晶体阵列斑点勉强以上的噪音水平的FT。
虽然在更高的分辨率数据已经收集到少量的样品6，常用的负染的二维晶体的分辨率是有限的或不应该预计比大约15A的分辨率更好。一个散焦约-400纳米，不超过1-3点的订单，预计将很容易识别。样品一般都没有评估决议，冷冻电镜收集数据，将给予最高可实现分辨率的适当指示。指出虽然点和可能mosaicity的清晰度。
- 膜，以及不同的膜形貌，是为了在高放大倍率的评估。这是关键，特别是在开始或中间阶段的二维结晶试验，小而不是更大的proteoliposomes或膜补丁可以包含最有前途的领域。二维晶体非常低的百分比，将需要图像采集和FT，或大量的图像有序阵列的初步鉴定，因为经常会导致2,4,7的规模和质量的迅速改善光学衍射。
3。代表性的成果
理想的情况下下令proteoliposomes显示容易辨认，清晰的斑点。在线FT CCD图像或光学显微衍射大型和有序的晶体很容易识别。
的例子显示，在几微米大小的18kDa的小膜蛋白的二维晶体。 “金融时报”上的斑点很容易识别和尖锐。活英尺箱的运动表明，晶格是连续的，没有mosaicity。可确定一个更大的蛋白质与更广泛的水溶性域的晶格上的小屏幕的EM。 CCD图像采集和FT是要提供一个更好的评估手段和获得信息，例如，可能mosaicity（显示英尺）。当计算一个没有下令proteoliposome FT噪音，可以初步被误为斑点。虽然生活- FT框移动，然而，斑点就会消失。另一方面，小数组，将可疑的结晶，有其时现场FT是移动的图像区域，甚至略有剩余的固定点。此外，这些小晶体可以被识别，通常具有相同的晶胞尺寸，并在不同的FTS点之间的距离可以测量各种方式，如与一个特定大小的的圆圈。脂质体显示不同的晶格形态和FT。
在初步试验中遇到的沉淀并不少见。这里没有重组蛋白沉淀，需要从虽然小脂质聚集区分开来。样品出现沉淀在低倍率频繁转出脂质聚集在更高的放大倍率观察。在30 - 50K的检查后，这些黑暗结构的边缘，显示他们没有沉淀的蛋白质组成的膜。这些都是重要的观察脂质聚集的大小可能会增加，在下面的实验大膜。
评估样品的效果差，有时连接到一个低的膜的浓度，以防止正确和快速筛选。这常常被克服二维结晶的使用提出了更高的蛋白浓度的透析。另外，膜可以留几天在底部的Eppendorf管中，在储存过程中解决。在某些情况下发生膜迅速，或几乎即时解决，移液管底部，将导致对电网的膜密度较高。另一种更快的选项离心随后从试管底部采样的样本（1-3分钟，在3000-8000 RPM）。
在最佳条件下的样品将包含一个二维晶体的很大比例。这是没有必要的膜齐亮相目标，作为最大的和最有序的二维晶体选定的数据可视化的集合。这些类型的样品，将很容易确认时的结晶试验以及用于样品时重复冷冻电镜收集数据，从而导致在高分辨率图像的最大数目。
图1此图显示了一个撕成片的Whatman＃4滤纸杂交电网的边缘。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
样品进行适当的评价，需要认真评估的足够数量的膜。例如，低至2％的晶体阵列成像proteoliposomes超过180的样品给了二维结晶条件的快速优化的关键信息。
蛋白质沉淀发生时，一个网格可能被放弃进一步的筛选后，在低倍率的检查，虽然偶尔出现部分沉淀的蛋白质。即使很小小于100 nm的膜虽然可以给有关订单的有用信息，并增加二维晶体大小的参数，可以在以下透析实验实施。
实验室在筛选8,9的过程中引入不同程度的有前途的自动化过程。然而，样品将仍然需要评价和知识的二维晶体的大小，形态和秩序的步骤。在未来的日子里，它可能会变得越来越小的二维晶体分析数据，以更高的分辨率，使得这些筛选步骤，更小，更关键的结晶领域更困难的评价。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
我们感谢我们的合作者提供了宝贵的蛋白质样品，这有助于我们的方法相关的经验和观察一些。德博Schmalzing好心提供了机会，为fr加入这个项目。芭芭拉Armbruster，雅各Brink和德里克米尔斯是他们的杰出的帮助和设备上的投入表示感谢。经费是由美国国立卫生研究院授予HL090630。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | |||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | ||
| Micropipette and pipette tips | |||
| Whatman #4 filter paper | |||
| 1% uranyl acetate | |||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | |||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | ||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
References
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy. Methods. 41, 417-426 (2007).
- Wang, D. N., Kühlbrandt, W. High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media. J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).
- Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles. Micron. , (2010).
- Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent γ-glutamyl carboxylase. J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).
- Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 Å resolution. J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).
- Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters. J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).
- Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. Towards automated screening of two-dimensional crystals. J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).
- Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).
