Summary
Evaluatie van twee-dimensionale (2D) kristallisatie onderzoeken voor de vorming van de bestelde membraaneiwit arrays is een zeer kritische en moeilijke taak in elektron kristallografie. Hier beschrijven we onze aanpak in het screenen en identificeren van 2D-kristallen van overwegend kleine membraaneiwitten in de range van 15 - 90kDa.
Abstract
Electron kristallografie heeft zich ontwikkeld als een methode die kan als alternatief of in combinatie met een drie-dimensionale kristallisatie en X-ray kristallografie om structuur-functie vragen van membraaneiwitten, evenals oplosbare eiwitten studie worden gebruikt. Screening voor twee-dimensionale (2D) kristallen door transmissie elektronenmicroscopie (EM) is de belangrijkste stap in het vinden van, het optimaliseren, en het selecteren van monsters voor hoge-resolutie de gegevensverzameling door de cryo-EM. Hier beschrijven we de fundamentele stappen in het identificeren van zowel grote en beval, evenals kleine 2D-arrays, dat kritieke informatie kan mogelijk leveren voor de optimalisatie van kristallisatie omstandigheden.
Door te werken met verschillende vergrotingen op de EM, worden gegevens over een reeks van kritische parameters verkregen. Lagere vergroting levert waardevolle gegevens op de morfologie en de membraan grootte. Bij hogere vergrotingen, zijn mogelijk orde en 2D-kristallen afmetingen bepaald. In dit kader wordt beschreven hoe de CCD-camera's en de online-Fourier transformaties worden gebruikt bij hogere vergrotingen te proteoliposomen voor orde en grootte te beoordelen.
Terwijl de 2D-kristallen van membraaneiwitten worden meestal geteeld door reconstitutie door middel van dialyse, de screening techniek is evenzeer van toepassing is voor de kristallen geproduceerd met behulp van monolagen, inheemse 2D-kristallen, en bestelde arrays van oplosbare eiwitten. Daarnaast is de hier beschreven methoden zijn van toepassing op de screening voor 2D kristallen van nog kleinere en grotere membraaneiwitten, waar kleinere eiwitten dezelfde hoeveelheid zorg nodig hebben in de identificatie als onze voorbeelden en het rooster van grotere eiwitten zouden meer herkenbaar worden in eerdere stadia van de screening.
Protocol
1. Grid Voorbereiding van de 2D-Kristallisatie Trials
- Koolstof beklede 400-mesh koper EM roosters worden voorbereid door een negatieve vlek. Uranylacetaat wordt veelvuldig gebruikt en biedt een langdurige op het gebied van opslag van de oplossing vlek voor enkele maanden voordat gebruik en geschikt voor langdurige opslag van netten. In tegenstelling tot andere negatieve vlekken zoals uranyl formaat, terwijl het een uitstekende kleuring, moet vers worden gemaakt 1. Voor een snelle bereiding van een groot aantal van rasters worden gebruikt voor het screenen van 2D-kristallisatie onderzoeken, is een aangepaste versie van negatieve kleuring gebruikt. Een volume van 2 pl van het monster is gepipetteerd op een koolstof-overdekte EM rooster en geïncubeerd gedurende 60 s. Dit wordt gevolgd door blotting van de rand met een gescheurd stuk Whatman # 4 papieren filter (zie figuur 1, video), en dan 2 uL van 1% uranylacetaat worden onmiddellijk toegepast, zijn die weer uitgewist vanaf de rand van het rooster na 30 s. Het aanraken van het rooster op de rand met de gescheurde rand van het filter papier zorgt voor een optimale verwijdering van vloeistof zonder verwijdering van proteoliposomen. Bovendien, drogen aan de rand van het rooster zorgt voor een betere conservering van de koolstof film. Zorg moet worden genomen in de voorbereiding en de behandeling van de netten, zoals het breken van de delicate koolstof film voorkomt monster hechting en kan resulteren in een onjuiste voorstelling van het monster. Terwijl traditioneel grotere steekproef volumes van 5 microliter werden en worden routinematig gebruikt voor grid voorbereiding, kan kostbare monsters worden gered door vermindering van het volume op 2 pL of minder 2.
- Voor de productie van de grootst mogelijke membranen, een aantal van onze samples nodig hebben hoge concentraties van glycerol of sucrose (10-20%) aanwezig te zijn in de dialyse buffer. Dit kan een negatief effect hebben op de rooster voorbereiding, zoals glycerol of sucrose is zeer viskeuze en voorkomt uranylacetaat van goed penetreren van de buffer, en dus onvolledig kleuren van de membranen. Dus een mogelijke rooster zal worden verduisterd. Ofwel de buffer kan worden uitgewisseld door middel van centrifugeren van de monsters en vervanging door glycerol / sucrose-vrije buffer (niet getoond), of de roosters kan worden gewassen met een buffer of glycerol / sucrose-vrije buffer in een tot meerdere cycli voordat negatieve kleuring vergelijkbaar met een techniek die wordt gebruikt voor de cryo-EM 3,4.
2. Het beoordelen van 2D Kristallisatie Trials door EM
- Afhankelijk van het type van een monsterhouder, zijn ofwel een of meerdere roosters geplaatst. Een vergroting van 2-10K, die hier worden aangeduid als tussenproduct vergroting, zorgt voor een eerste indruk van de gemiddelde distributie en de mate van verspreiding van membranen, morfologie, en grootte, die is genomen van in het laboratorium notebook 5. Geschikte gebieden worden opgenomen als vertegenwoordiger overzichten met behulp van een CCD-camera of, indien een CCD-camera is niet beschikbaar is, op film.
- Lage vergroting in het bereik van ongeveer 400-800x wordt gebruikt op momenten dat een overzicht van het gehele monster / grid gewenst is. Hoewel niet in dienst bij iedere netbeheerder, lage vergroting geeft waardevolle informatie van hulp bij de evaluatie van het rooster opstellen op het gebied van verschillende aspecten: zowel negatieve kleuring en de potentiële gedeeltelijke breuk van koolstof film, monster de concentratie op de grid, en eventueel ongelijke proteoliposome distributie. Individuele hokken kunnen worden bekeken met de verrekijker of CCD-camera. Bij sommige EM is het mogelijk om op te slaan posities van bijzonder belang, dat kan voor latere inspectie worden opgeroepen bij hogere vergrotingen.
- Zodra een raster gebied van belang is vastgesteld op een van beide lage of intermediaire vergroting, is de vergroting veranderd naar ongeveer 50K-60K. Afhankelijk van de membraan, kristal en eenheid celgrootte, indien bekend, vergrotingen zo laag 30K en hoog is als 80K worden gebruikt. De vergroting bereik van 30-80K zal worden aangeduid als een hoge vergrotingsfactor voor het doel van de screening voor 2D-kristallen. Scherpstellen gebeurt ofwel in de scherpstelling van de lage dosis set-up, met aansluitend schakelaar om de afbeelding / foto instelling, of in de buurt van het gebied van belang.
- In geval van onduidelijkheid in of het gebied van belang is inderdaad een membraan, wordt het monster onderzocht op koolstof-film in de grootte van proteoliposomen, mica of andere artefacten. Voor dit doel, randen onthullen typische vouw-en morfologie.
- Nu het gebied van belang is geïnspecteerd met een CCD-camera. Een CCD is verzameld op 30K-80K vergroting, afhankelijk van de grootte van membraan, eiwit of eenheid celgrootte, of bekende kristallijne gebied. Het rooster van een kleinere en / of overwegend hydrofobe membraan-eiwit is niet per se zichtbaar door visuele beoordeling van de CCD zelf. Ofwel het gehele beeld wordt gebruikt voor een online-Fourier transformatie (FT, of snel FT-FFT). Dit FT zal een aanzienlijke hoeveelheid ruis bevatten echter, als het bestelde array is klein. Zo zal een minder boxed beeldformaat zorgen voor een verbeterde signaal-ruisverhouding van een smaller kristal en makkelijker identificatie. Voor dit doel, is de box verplaatst over de afbeelding en een live-FT wordt geëvalueerd.
De intensiteit / helderheid van de bundel wordt aangepast houden van een lage dosis voorwaarden voor het monster, evenals CCD-camera-instellingen in het achterhoofd. Afhankelijk van de gebruikte CCD-camera, is het gamma van de live FT aangepast voor optimale identificatie van bestelde arrays. Een te hoge waarde kan obscure plekken ten gevolge van lawaai bijdragen, en een te lage gamma-waarde zal zwakkere plekken voorkomen worden geïdentificeerd. Deze zwakkere plekken kan te wijten zijn aan kleinere kristallijne arrays met vlekken in de FT nauwelijks boven het ruisniveau.
Terwijl de gegevens met een hogere resolutie zijn verzameld van een klein aantal monsters 6, wordt vaak de resolutie van negatief gekleurde 2D-kristallen beperkt tot of mag niet worden verwacht beter te zijn dan ongeveer 15A resolutie. Met een onscherp van ongeveer -400 nm, niet meer dan 1-3 orden van plekken wordt verwacht dat ze gemakkelijk worden geïdentificeerd. Monsters zijn over het algemeen niet geëvalueerd voor resolutie, zoals cryo-EM het verzamelen van gegevens zal een goede indicatie van de hoogst haalbare resolutie te geven. Scherpte van vlekken en mogelijke mosaicity zijn echter opgemerkt.
- Verschillende membranen, evenals membraan morfologie, worden geëvalueerd voor orde bij een hoge vergrotingsfactor. Dit is vooral kritisch bij het begin of intermediaire stadia van 2D-kristallisatie onderzoeken, als kleiner dan groter proteoliposomen of membraan patches kunnen bevatten de meest veelbelovende gebieden. Zeer lage percentages van 2D-kristallen vereist beeldacquisitie en FT, of optische diffractie, van een groot aantal beelden, aangezien initiële identificatie van de bestelde arrays vaak zal leiden tot een snelle verbetering van de grootte en kwaliteit 2,4,7.
3. Representatieve resultaten
Idealiter besteld proteoliposomen weer duidelijk herkenbaar, scherpe punten. Grote en goed geordende kristallen zijn gemakkelijk te herkennen door de online-FT van de CCD beelden of optische diffractie van microfoto.
Het voorbeeld toont 2D-kristallen van een kleine membraan eiwit van 18kDa die tot zijn enkele microns in grootte. Vlekken op de FT zijn gemakkelijk te herkennen en scherp. De beweging van de live-FT box laat zien dat het rooster is continu zonder mosaicity. Het rooster van een groter eiwit met een meer uitgebreide oplosbaar domein kan worden geïdentificeerd op het kleine scherm van de EM. CCD-collectie en FT is nodig om een middel om betere beoordeling geven en om informatie te krijgen over, bijvoorbeeld, mogelijk mosaicity (toon FT). Bij de berekening van een FT van een proteoliposome dat niet is besteld, kan geluid in eerste instantie worden verward met vlekken. Terwijl de box voor de live-FT wordt verplaatst, zal echter de vlekken verdwijnen. Aan de andere kant, kleine arrays, met twijfelachtige kristalliniteit, zullen hun plaatsen blijven stilstaan wanneer de live-FT is zelfs iets verplaatst het beeld. Bovendien kunnen deze kleine kristallen te herkennen aan meestal met dezelfde eenheidscel maten en afstanden tussen de verschillende plekken in FTS kan gemeten worden op verschillende manieren, bijvoorbeeld met een cirkel van een bepaalde grootte. Lipide kristallen tonen een duidelijke rooster morfologie en FT.
Het is niet ongewoon om neerslag tegenkomen in de eerste proeven. Hier eiwit neerslag zonder reconstitutie dient te worden onderscheiden van kleine lipide aggregaten wel. Monsters die lijken te zijn neerslaat bij een lage vergroting vaak blijken te zijn lipide aggregaten wanneer bekeken bij hogere vergroting. Bij inspectie op 30-50K, de randen van deze duistere structuren onthullen ze zijn samengesteld uit membranen met geen neerslag van het eiwit. Dit zijn belangrijke observaties als de lipide aggregaten zou kunnen worden vergroot tot grote membranen in de volgende experimenten.
Slechte resultaten bij de evaluatie van monsters zijn soms verbonden met een lage concentratie membraan dat een goede en snelle screening voorkomt. Dit kan vaak worden overwonnen met het gebruik van een hogere eiwitconcentratie voor 2D-kristallisatie door middel van dialyse. Als alternatief kan de membranen worden overgelaten om zich te vestigen voor een paar dagen op de bodem van de Eppendorf buis tijdens opslag. In sommige gevallen is een snelle, of bijna direct afhandelen van membranen plaatsvindt en pipetteren van de bodem van de buis zal resulteren in een hogere dichtheid membraan op de grid. Een andere optie is veel sneller centrifugeren (in 3000 tot 8.000 toeren per minuut voor 1-3 minuten) van monsters met opnieuw monsters worden genomen van de bodem van de buis.
Monsters onder optimale omstandigheden bevat een groot percentage van 2D-kristallen. Het is niet nodig om te streven naar een homogene uitstraling van membranen, als de grootste en meest overzichtelijke 2D-kristallen zijn visueel geselecteerd voor het verzamelen van gegevens. Deze types van monsters gemakkelijk worden herkend wanneer de kristallisatie studies zijn als wanneer de monsters worden gebruikt voor herhaaldecryo-EM het verzamelen van gegevens, wat resulteert in een maximum aantal van hoge resolutie beelden.
Figuur 1. Deze afbeelding toont blotting de rand van het raster met een gescheurde stuk Whatman # 4 filtreerpapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Goede evaluatie van monsters vereist een zorgvuldige evaluatie van een voldoende aantal van membranen. Bijvoorbeeld, monsters met zo laag als 2% kristallijn arrays uit van meer dan 180 afgebeeld proteoliposomen gaf essentiële informatie voor een snelle optimalisatie van de 2D-kristallisatie voorwaarden 7.
Als neerslag van het eiwit optreedt, kan een rooster worden afgezien van verdere screening na de inspectie bij een lage vergroting, hoewel af en toe een gedeeltelijke neerslag van eiwitten optreedt. Zelfs zeer kleine membranen van minder dan 100 nm kan geven nuttige informatie over order echter, en parameters om de 2D kristal vergroten geïmplementeerd kunnen worden in de volgende dialyse experimenten.
Laboratoria zijn in het proces van de invoering van verschillende gradaties van veelbelovende automatisering in het proces van screening 8,9. Toch monsters zullen moeten nog stappen van de evaluatie en de kennis van de 2D kristal grootte, morfologie, en volgorde zoals hier geschetst. In de toekomst zou het mogelijk geworden om gegevens van steeds kleinere 2D-kristallen te analyseren om een hogere resolutie, waardoor deze screening stappen en de moeilijkere evaluatie van kleinere kristallijne gebieden nog meer kritiek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken onze medewerkers voor het leveren van waardevolle eiwitten monsters, die hebben bijgedragen tot een aantal van onze methodes met betrekking ervaring en observaties. Günther Schmalzing vriendelijk de gelegenheid om FR om dit project aan te sluiten. Barbara Armbruster, Jacob Brink en Deryck Mills worden bedankt voor hun uitstekende hulp en inbreng van de apparatuur. De financiering werd verstrekt door NIH subsidie HL090630.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | |||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | ||
| Micropipette and pipette tips | |||
| Whatman #4 filter paper | |||
| 1% uranyl acetate | |||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | |||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | ||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
References
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy. Methods. 41, 417-426 (2007).
- Wang, D. N., Kühlbrandt, W. High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media. J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).
- Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles. Micron. , (2010).
- Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent γ-glutamyl carboxylase. J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).
- Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 Å resolution. J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).
- Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters. J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).
- Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. Towards automated screening of two-dimensional crystals. J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).
- Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).
