Summary
הערכת דו ממדי (2D) ניסויים התגבשות להקמת מערכי חלבון הורה הממברנה היא משימה קריטית מאוד קשה קריסטלוגרפיה אלקטרונים. כאן אנו מתארים את הגישה שלנו ההקרנה וזיהוי 2D גבישים של חלבונים בממברנה קטן בעיקר בטווח של 15 - 90kDa.
Abstract
קריסטלוגרפיה אלקטרונים התפתח כשיטה שניתן להשתמש בהם או לחילופין או בשילוב עם התגבשות תלת ממדי ו-X-ray קריסטלוגרפיה ללמוד מבנה שאלות פונקציה של חלבונים בממברנה, כמו גם חלבונים מסיסים. הקרנת עבור דו ממדי (2D) גבישים על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (EM) הוא שלב קריטי למציאת, אופטימיזציה, ובחירת דוגמאות לאיסוף נתונים ברזולוציה גבוהה על ידי cryo-EM. כאן אנו מתארים את הפעולות הבסיסיות בזיהוי הן גדולות והורה, וכן מערכי 2D קטנים, שעלולים לספק מידע קריטי עבור אופטימיזציה של תנאי התגבשות.
על ידי עבודה עם בהגדלה שונים EM, נתונים על מגוון של פרמטרים קריטיים מתקבל. הגדלה תחתון מספקת נתונים חשובים על גודל המורפולוגיה הממברנה. בהגדלה גבוהה, ניתן להזמין 2D ממדים קריסטל נחושים. בהקשר זה, הוא תיאר כיצד מצלמות CCD ו-פורייה באינטרנט הופך משמשים בהגדלה גבוהה יותר כדי להעריך proteoliposomes לסדר גודל.
בעוד 2D גבישים של חלבונים בממברנה גדלים בדרך כלל על ידי הכינון מחדש על ידי דיאליזה, הטכניקה ההקרנה הוא ישים באותה מידה עבור גבישים המיוצר בעזרת monolayers, קריסטלים 2D הילידים, והורה מערכים של חלבונים מסיסים. בנוסף, בשיטות המתוארות כאן החלות על ההקרנה עבור 2D של גבישים קטנים עוד יותר, כמו גם חלבונים בממברנה גדול, שבו חלבונים קטנים דורשים את אותה כמות של טיפול זיהוי כדוגמאות שלנו הסריג של חלבונים גדול יכול להיות בקלות רבה יותר לזיהוי בשלבים קודמות של ההקרנה.
Protocol
1. רשת הכנה לניסויים התגבשות 2D
- פחמן מצופה 400-EM רשת רשתות נחושת מוכנים על ידי כתם שלילי. אצטט Uranyl משמש לעתים קרובות ומספק לטווח ארוך כתם במונחים של אחסון של הפתרון במשך כמה חודשים לפני השימוש, כמו גם התאמה עבור אחסון לטווח ארוך של רשתות. לעומת זאת, כתמים שליליות אחרות כגון formate uranyl, תוך מתן מכתים מעולה, צריכים להיות טריים 1. עבור הכנה מהירה של מספר רב של רשתות לשמש ההקרנה של ניסויים התגבשות 2D, בגרסה אחרת של מכתים שלילי משמש. נפח של 2 μL של המדגם הוא pipetted על גבי רשת פחמן מכוסה EM וטופחו במשך 60 s. זה ואחריו סופג מהקצה עם חתיכת קרועות Whatman # 4 נייר פילטר (איור 1; וידאו) ולאחר מכן 2 μL של אצטט uranyl 1% מוחלים מיד, אשר שוב מחק מן הקצה של הרשת לאחר 30 s. נגיעה ברשת על שפת עם קצה נייר קרועות המסנן מבטיח הסרת אופטימלי של נוזל ללא הסרת proteoliposomes. יתר על כן, ייבוש בקצה הרשת מבטיחה שימור משופר של הסרט פחמן. יש להקפיד בהכנה וטיפול של רשתות, כמו שבירה של הסרט פחמן עדין מונע הידבקות מדגם יכול לגרום ייצוג מדויק של המדגם. בעוד כרכים מדגם באופן מסורתי יותר של μL 5 היו משמשים באופן שגרתי להכנת הרשת, דגימות יקרות ניתן לשמור על ידי הקטנת נפח μL 2 או פחות 2.
- כדי לייצר את הממברנות הגדול ביותר האפשרי, כמה דגימות שלנו דורשים הריכוזים הגבוהים של גליצרול או סוכרוז (10-20%) להיות נוכח למאגר דיאליזה. זו יכולה להיות השפעה שלילית על הכנת רשת, כמו גליצרול או סוכרוז היא צמיגה מאוד ומונע אצטט מתוך uranyl שצריך לחדור למאגר, ובכך חלקי מכתים את הקרומים. כתוצאה מכך סריג אפשרי יהיה מוסתר. או החיץ ניתן להחליף על ידי צנטריפוגה של דגימות והחלפת על ידי חיץ גליצרול / סוכרוז נקי (לא מוצג), או רשתות ניתן לכבס עם חיץ או גליצרול / סוכרוז ללא חיץ אחד מחזורים ספורים לפני מכתים שלילי דומה טכניקה המשמשת עבור cryo-EM 3,4.
2. הערכת ניסויים התגבשות 2D על ידי א.מ.
- בהתאם לסוג של בעל המדגם, או רשתות אחת או מספר נטענים. הגדלה של 2-10K, אשר ייקראו כאן הגדלה ביניים, המאפשר הופעה ראשונה של הפצה בהיקף ממוצע של פיזור של ממברנות, מורפולוגיה, וגודל, אשר נלקח לב במחברת מעבדה 5. אזורים מתאים נרשמות סקירות נציג בעזרת מצלמה CCD או, אם מצלמה CCD אינו זמין, על הסרט.
- בהגדלה נמוכה בטווח של בערך 400-800x משמש בשעות סקירה של כל מדגם / רשת הוא הרצוי. אמנם לא כל מועסק עם רשת, בהגדלה נמוכה נותן מידע רב ערך לסייע בהערכת הכנת הרשת במונחים של מספר היבטים: הן מכתים שלילי שבירה חלקית הפוטנציאל של הסרט פחמן, ריכוז מדגם על הרשת, הפצה אחידה proteoliposome אולי. ריבועים רשת בודדת עלול להיתפס עם משקפת או מצלמה CCD. עם כמה EMS אפשר לחסוך עמדות עניין מיוחד, אשר ניתן לבדיקה נזכר מאוחר יותר בהגדלה גבוהה יותר.
- פעם באזור רשת של עניין זוהתה בהגדלה או נמוכה או בינונית, הגדלה משתנה 60K-50K בערך. בהתאם קריסטל קרום, ותא גודל היחידה, אם הוא ידוע, בהגדלה נמוך כמו 30K ו גבוה ככל 80k משמשים. טווח הגדלה של 30-80k יהיה המכונה בהגדלה גבוהה לצורך ההקרנה עבור גבישים 2D. ההתמקדות מתרחשת גם בסביבה מוקד במינון נמוך הגדרת, עם הבורר לאחר הגדרת תמונה / צילום, או בקרבת שטח של עניין.
- במקרים של אי בהירות בשאלה אם האזור של עניין הוא אכן קרום, המדגם נבדק לסרט פחמן בגודל של proteoliposomes, נציץ, או חפצים אחרים. לענין זה, לחשוף את קצוות מתקפלים מורפולוגיה טיפוסית.
- עכשיו לאזור של עניין נבדק עם מצלמת CCD. תמונה CCD נאסף בהגדלה 30K-80k, תלוי בגודל הממברנה, חלבונים או תאים גודל יחידה, או ידוע אזור גבישי. סריג של חלבון ממברנה קטנות ו / או הידרופובי לרוב אינו גלוי בהכרח הערכה חזותית של התמונה CCD עצמו. או התמונה כולה משמשת להפוך מקוונת, פורייה (FT, או מהר FT-FFT). FT זה יכיל כמות משמעותית של רעש, לעומת זאת, אם מערך הורה הוא קטן. לפיכך, גודל התמונה מופחת התאגרף תאפשר יחס אות לרעש משופר של smalהימלר קריסטל זיהוי קל יותר. למטרה זו, תיבת מועבר על התמונה ו FT לחיות מוערך.
עוצמת / בהירות של הקורה מותאם שמירה במינון נמוך התנאים המדגם, וכן הגדרות מצלמת CCD בראש. בהתאם למצלמה CCD בשימוש, גמא של FT חיים מותאם לזיהוי אופטימלי של מערכים מסודרים. ערך גבוה מדי יכול לטשטש כתמים בשל תרומות רעש, ערך גאמה נמוך מדי ימנע כתמים חלשים יותר מלהיות מזוהה. אלה הנקודות החלשות ייתכן שהדבר נובע מערכים גבישי קטן עם כתמים את רגל בקושי מעל רמת הרעש.
למרות נתונים ברזולוציה גבוהה יותר נאסף מספר קטן של דוגמאות 6, בדרך כלל ההחלטה של גבישים 2D צבעונית שלילית מוגבלת או לא צריך להיות צפוי להיות טוב יותר ברזולוציה 15A בערך. עם defocus של כ -400 ננומטר, לא יותר מ 1-3 הזמנות של כתמים צפויים להיות מזוהה בקלות. דוגמאות הם בדרך כלל לא העריכו לפתרון, כמו cryo-EM איסוף נתונים ייתן אינדיקציה נכונה של השגה ברזולוציה הגבוהה ביותר. חדות של כתמים mosaicity האפשריים הם ציינו כי.
- ממברנות שונות, כמו גם מורפולוגיות קרום, מוערכות על מנת בהגדלה גבוהה. זה קריטי במיוחד בתחילת או שלבי הביניים של ניסויים התגבשות 2D, כמו proteoliposomes קטנים ולא גדולים או טלאים קרום יכול להכיל האזורים המבטיחים ביותר. אחוז נמוך מאוד של גבישים 2D ידרוש רכישת התמונה FT, או עקיפה אופטית, של מספר רב של תמונות מאז הזיהוי הראשוני של מערכים הורה יהיה לעתים קרובות להביא לשיפור מהיר של גודל ואיכות 2,4,7.
3. נציג תוצאות
Proteoliposomes הורה אידיאלי להציג לזיהוי בקלות, פינות חדות. גבישים גדולים המסודר מזוהים בקלות על ידי המקוון-FT של תמונות CCD או עקיפה אופטי של micrographs.
הדוגמה מראה 2D גבישים של חלבון ממברנה קטנה של 18kDa כי הם עד כמה מיקרונים בגודל. כתמים על FT מזוהים בקלות חדות. התנועה של התיבה לחיות FT מראה כי הסריג היא רציפה ללא mosaicity. הסריג של חלבון גדול יותר עם תחום מסיסים נרחב יותר ניתן לזהות על המסך הקטן של EM. אוסף CCD התמונה FT יש צורך לספק אמצעי הערכה טובה יותר כדי לקבל מידע על mosaicity, למשל אפשרי (הצג FT). בחישוב של FT proteoliposome שאינו הורה, רעש יכול להיות בתחילה בטעות כתמים. אמנם התיבה של live-FT הוא עבר, עם זאת, כתמים ייעלמו. מצד שני, מערכים קטנים, עם crystallinity בספק, יהיו כתמים שלהם הנותר נייח כאשר חי FT מועבר ולו במעט על פני שטח התמונה. יתר על כן, גבישים אלה קטן יכול להיות מוכר על ידי כלל שיש התא גדלים באותה יחידה, ואת המרחקים בין נקודות ב FTS שונים ניתן למדוד בדרכים שונות, כגון עם עיגול בגודל מסוים. גבישים ליפידים להציג מורפולוגיה סריג FT ברורים.
אין זה נדיר להיתקל משקעים בניסויים הראשונים. כאן משקעים חלבון ללא הכינון מחדש צריך להיות נבדל אגרגטים השומנים קטן אף. דוגמאות שנראים משקעים בהגדלה נמוכה לעתים קרובות להתברר אגרגטים השומנים כאשר צפו בהגדלה גבוהה יותר. לאחר בדיקה ב 30-50K, את הקצוות של מבנים אלה אפל לחשוף אותם להיות מורכבת של ממברנות עם משקעים לא של החלבון. אלו תצפיות חשובות כמו אגרגטים השומנים עשוי להיות מוגברת בגודל ממברנות גדול בניסויים הבאים.
תוצאות Poor בדגימות הערכת המחוברים לפעמים ריכוז נמוך קרום שמונע הקרנת נכונה ומהירה. זה יכול להיות לעתים קרובות להתגבר עם השימוש של ריכוז חלבון גבוה יותר עבור התגבשות 2D על ידי דיאליזה. לחלופין, הקרומים ניתן להשאיר להתיישב לכמה ימים בתחתית הצינור Eppendorf במהלך האחסון. במקרים מסוימים ליישוב מהיר, או כמעט מיידית של ממברנות מתרחשת pipetting מהחלק התחתון של הצינור תגרום קרום צפיפות גבוהה על הרשת. אפשרות נוספת היא הרבה יותר מהר צנטריפוגה (בסל"ד 3000-8000 דקות 1-3) של דגימות עם דגימה הבאים מתחתית הצינור.
דוגמאות בתנאים אופטימליים יכלול אחוז גדול של גבישים 2D. אין צורך לכוון מראה הומוגני של ממברנות, כאוסף הגדול ביותר גבישים 2D המסודר נבחרו חזותית של נתונים. סוגים אלה של דוגמיות תוכר בקלות כאשר התגבשות ניסויים חוזרים כמו גם כאשר דגימות משמשיםcryo-EM איסוף נתונים, וכתוצאה מכך מספר מרבי של תמונות ברזולוציה גבוהה.
באיור 1. נתון זה מראה סופג את הקצה של הרשת עם חתיכת קרועות Whatman # 4 נייר הסינון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הערכה נכונה של דגימות דורש הערכה זהירה של מספר מספיק של ממברנות. לדוגמה, עם דגימות נמוך כמו 2% מערכי גבישי מתוך מעל 180 proteoliposomes הדמיה מסר מידע קריטי עבור אופטימיזציה מהירה של התגבשות התנאים 2D 7.
כאשר משקעים של החלבון מתרחשת, רשת יכול להיות נטוש מן ההקרנה נוספת לאחר בדיקה בהגדלה נמוכה, למרות המשקעים חלקית מזדמנת של חלבון מתרחשת. גם ממברנות קטן מאוד של פחות מ -100 ננומטר יכול לתת מידע מועיל על פי סדר, והפרמטרים להגדיל את גודל גביש 2D יכול להיות מיושם בניסויים הבאים דיאליזה.
מעבדות נמצאים בתהליך של החדרת בדרגות שונות של אוטומציה מבטיח לתוך תהליך של סינון 8,9. עם זאת, דגימות עדיין דורשים צעדים של הערכה והכרת גודל הגביש מורפולוגיה 2D, והסדר כפי שתואר כאן. בעתיד, זה יכול להיות אפשרי לנתח נתונים של גבישים קטנים יותר ויותר 2D ברזולוציה גבוהה יותר, מה שהופך את הפעולות ההקרנה ההערכה קשה יותר של אזורים גבישיים קטנים אפילו יותר קריטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים משתפי הפעולה שלנו לספק דגימות חלבון בעל ערך, אשר תרמו חלק מניסיוננו שיטות ותצפיות בנושא. גינטר Schmalzing חביב סיפק את ההזדמנות FR להצטרף לפרויקט. ברברה Armbruster, יעקב ברינק ו Deryck מילס הם הודו על העזרה מצטיינים שלהם קלט על ציוד. המימון ניתן על ידי NIH מענק HL090630.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | |||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | ||
| Micropipette and pipette tips | |||
| Whatman #4 filter paper | |||
| 1% uranyl acetate | |||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | |||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | ||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
References
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy. Methods. 41, 417-426 (2007).
- Wang, D. N., Kühlbrandt, W. High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media. J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).
- Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles. Micron. , (2010).
- Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent γ-glutamyl carboxylase. J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).
- Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 Å resolution. J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).
- Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters. J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).
- Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. Towards automated screening of two-dimensional crystals. J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).
- Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).
