Summary
Utvärdering av tvådimensionella (2D) kristallisering prövningar för bildandet av beställda arrayer membranprotein är en mycket viktig och svår uppgift i elektron kristallografi. Här beskriver vi vår strategi i screening för och identifiera 2D kristaller i framför allt små membranproteiner i intervallet 15 - 90kDa.
Abstract
Electron kristallografi har utvecklats som en metod som kan användas antingen alternativt eller i kombination med tredimensionella kristallisation och röntgenkristallografi för att studera struktur och funktion frågor om membranproteiner, samt lösliga proteiner. Screening för tvådimensionella (2D) kristaller av transmissionselektronmikroskop (EM) är den kritiska steget i att hitta, optimering och välja ut provexemplar för hög upplösning datainsamling av Cryo-EM. Här beskriver vi de grundläggande stegen i att identifiera såväl stora som beställts, samt små 2D-arrayer, som potentiellt kan leverera kritisk information för optimering av kristallisering villkor.
Genom att arbeta med olika förstoring på EM, är uppgifter om ett antal kritiska parametrar erhållits. Lägre förstoring levererar värdefulla data på morfologi och membran storlek. Vid högre förstoring är möjliga för-och 2D kristall dimensioner bestäms. I detta sammanhang är det beskrivs hur CCD-kameror och online-Fouriertransformer används vid högre förstoringar att bedöma proteoliposomes för beställning och storlek.
Även om 2D-kristaller av membranproteiner är oftast vuxit med beredning av dialys, är screening tekniken lika tillämpliga för kristaller som produceras med hjälp av monolager, infödda 2D-kristaller, och beställde arrayer av lösliga proteiner. Dessutom, de metoder som beskrivs här gäller för screening för 2D-kristaller av ännu mindre såväl som större membranproteiner, där mindre proteiner kräver samma mängd vård i identifiering våra exempel och galler av större proteiner kan vara lättare att identifiera i tidigare skeden av screening.
Protocol
1. Grid Beredning av 2D Crystallization Trials
- Kolbelagda 400-nät koppar EM nät bereds av negativa fläcken. AUC acetat används ofta och ger en långvarig fläck när det gäller lagring av lösningen i flera månader före användning samt lämplighet för långtidslagring av nät. Däremot andra negativa fläckar som AUC formiat, samtidigt som den ger utmärkt färgning, måste nybakade 1. För snabb beredning av ett stort antal nät som ska användas för screening av 2D kristallisering prövningar, är en modifierad version av negativ färgning används. En volym på 2 mikroliter av provet pipetteras på ett kol täckt-EM nätet och inkuberas i 60 s. Detta följs av blotting från kanten med en sönderriven bit Whatman # 4 filterpapper (Figur 1, video) och sedan 2 mikroliter 1% AUC acetat tillämpas omedelbart, som är åter utplånas från kanten av nätet efter 30 S. Vidrör nätet på fälgen med den trasiga kanten av filtrerpappret säkerställer optimal borttagning av flytande utan avlägsnande av proteoliposomes. Dessutom garanterar torkning vid kanten av nätet bättre bevarande av kol filmen. Försiktighet måste vidtas för att förbereda och hantering av nät, som går sönder de fina kol filmen förhindrar prov vidhäftning och kan resultera i en felaktig föreställning av provet. Medan traditionellt större provvolymer av 5 mikroliter var och är rutinmässigt används för nätet beredning kan dyrbara prover sparas genom att minska volymen till 2 mikroliter eller mindre 2.
- För att producera största möjliga membran, några av våra prover kräver höga koncentrationer av glycerol eller sackaros (10-20%) att närvara i dialys buffert. Detta kan ha en negativ effekt på nätet förberedelser, som glycerol eller sackaros är mycket trögflytande och förhindrar AUC acetat från korrekt att tränga in i bufferten, och därmed ofullständigt färgning membranen. Följaktligen en möjlig galler kommer att skymmas. Antingen bufferten kan bytas genom centrifugering av proverna och ersätts med glycerol / sackaros-buffert (visas inte), eller galler kan rengöras med buffert eller glycerol / sackaros-buffert i en till flera gånger innan negativ färgning liknande en teknik som används för Cryo-EM 3,4.
2. Bedöma 2D Kristallisering Prövningar av EM
- Beroende på vilken typ av provhållaren, är antingen ett eller flera nät laddad. En förstoring av 2-10K, som kommer att hänvisas till här som mellanliggande förstoring, möjliggör ett första intryck av genomsnittlig fördelning och omfattning av spridning av membran, morfologi och storlek, som är noterat på laboratoriet bärbara 5. Lämpliga områden redovisas som representativa översikter med hjälp av en CCD-kamera, eller om en CCD-kamera inte är tillgänglig på film.
- Låg förstoring i intervallet ungefär 400-800x används vid tillfällen då en översikt av hela provet / rutnät önskas. Även om inte anställd med varje rutnät, ger låg förstoring värdefull information till hjälp i utvärderingen av nätet förberedelser i form av flera aspekter: både negativ färgning och potentiella delvis sönder av kol film, prov koncentration på nätet, och eventuellt ojämn proteoliposome distribution. Individuella rutor kan ses med kikare eller CCD-kamera. Med några snabba metaboliserare är det möjligt att spara lägen av särskilt intresse, som kan återkallas för senare inspektion vid större förstoring.
- När ett rutnät område av intresse har identifierats antingen låg eller medelhög förstoring är förstoringen ändras till cirka 50K-60K. Beroende på membranet, kristall och enhet cellstorlek, om känd, förstoringar så lågt som 30K och så högt som 80K används. Förstoringen utbudet av 30-80K kommer att kallas hög förstoring för att screening för 2D-kristaller. Fokusering sker antingen i fokus inställningen av lågdos-set-up, med efterföljande byta till bild / foto inställning, eller i närheten av området av intresse.
- I fall av oklarheter i huruvida det intressanta området är verkligen ett membran, provet inspekteras för kol-film i storlek proteoliposomes, glimmer eller andra artefakter. För detta ändamål kanter avslöjar typiska vikning och morfologi.
- Nu är området av intresse är inspekteras med en CCD-kamera. En CCD-bild är samlas in på 30K-80K förstoring, beroende på membran storlek, protein eller enhet cell storlek, eller känt kristallina område. Det galler av en mindre och / eller oftast hydrofoba membranprotein inte nödvändigtvis synlig genom visuell bedömning av CCD själva bilden. Antingen hela bilden används för en online-Fouriertransformen (FT, eller snabbt FT-FFT). Detta FT kommer att innehålla en betydande mängd brus, men om den beställda arrayen är liten. Således kommer en reducerad förpackade bildstorlek möjliggöra en bättre signal-brusförhållande på en smaller kristall och lättare identifiering. För detta ändamål är rutan flyttas över bilden och en levande FT utvärderas.
Intensiteten / ljusstyrka strålen är justerade hålla låg dos villkor för urvalet samt CCD-kamerans inställningar i åtanke. Beroende på CCD-kamera som används är gamma av levande FT justeras för optimal identifiering av beställda matriser. En alltför högt värde kan dölja fläckar på grund av buller bidrag, och en alltför låg gammavärde kommer att hindra svagare fläckar från att bli identifierade. Dessa svagare fläckar kan bero på att mindre kristallina celler med fläckar i FT knappt över ljudnivån.
Medan data vid högre upplösning har samlats in av ett litet antal prover 6, är vanligt att lösa negativt färgade 2D kristaller begränsat till eller borde inte förväntas vara bättre än ungefär 15a upplösning. Med en minskad fokus på cirka -400 nm, inte mer än 1-3 order av platserna förväntas vara lätt att identifiera. Proven är i allmänhet inte utvärderas för upplösning, som Cryo-EM datainsamling kommer att ge en korrekt indikation på högsta uppnåeliga upplösning. Skärpa av fläckar och eventuella mosaicity noteras dock.
- Olika membran, samt morfologier membran, utvärderas för att i hög förstoring. Detta är särskilt viktigt i början eller mellanliggande stadier av 2D kristallisering prövningar, eftersom mindre snarare än större proteoliposomes eller patchar membran kan innehålla de mest lovande områdena. Mycket låga procentandelar av 2D-kristaller kommer att kräva bild förvärv och FT, eller optisk diffraktion, av ett stort antal bilder sedan inledande identifiering av beställda matriser ofta leder till snabb förbättring av storlek och kvalitet 2,4,7.
3. Representativa resultat
Helst beställde proteoliposomes display lätt igenkännbara, skarpa fläckar. Stora och välordnade kristaller är lätt identifieras av online-FT CCD-bilder eller optisk diffraktion av micrographs.
Exemplet visar 2D-kristaller av en liten membranprotein av 18kDa som är upp till flera mikrometer i storlek. Fläckar på FT identifieras enkelt och skarpa. Förflyttning av levande FT rutan visar att gallret är kontinuerlig utan mosaicity. Det galler av ett större protein med en mer omfattande löslig domän kan identifieras på den lilla skärmen på EM. CCD-bild insamling och FT är nödvändigt att skapa ett medel för bättre bedömning och att få information om t ex möjligt mosaicity (visa FT). Vid beräkning av en FT i en proteoliposome som inte är beställt, kan buller initialt förväxlas med fläckar. Medan rutan för live-FT flyttas kommer dock fläckarna försvinna. Å andra sidan, små arrayer, med tvivelaktiga kristallinitet kommer att få sina fläckar står stilla när live-FT flyttas till något över bildytan. Dessutom kan dessa små kristaller kännas igen av brukar ha samma storlekar enhet cell och avstånd mellan punkter i olika FTS kan mätas på olika sätt, exempelvis med en cirkel av en viss storlek. Lipid kristaller visa en distinkt gitter morfologi och FT.
Det är inte ovanligt att stöta på nederbörd i första försöken. Här protein nederbörd utan rekonstituering måste skiljas från små lipid aggregat dock. Prover som verkar vara utfällningar vid låg förstoring tur ofta sig vara lipid aggregat när de ses i högre förstoring. Vid inspektion på 30-50K, kanterna på dessa mörka strukturer avslöjar dem bestå av membran med ingen utfällning av proteinet. Detta är viktiga observationer som lipid aggregat kan ökas i storlek till stora membran i följande experiment.
Dåliga resultat i utvärderingen prover ibland anslutna till ett membran koncentration som förhindrar korrekt och snabb screening. Detta kan ofta lösas med hjälp av en högre proteinkoncentration för 2D kristallisering av dialys. Alternativt kan membranen lämnas nöja sig med några dagar på botten av Eppendorf-rör under lagring. I vissa fall snabbt, eller nästan omedelbar reglering av membran uppstår och pipettera från botten av röret kommer att resultera i en högre membran densitet på nätet. En annan mycket snabbare alternativ är centrifugering (vid 3000-8000 rpm för 1-3 minuter) av prover med efterföljande provtagning från botten av röret.
Prover under optimala förhållanden kommer att innehålla en stor andel av 2D-kristaller. Det är inte nödvändigt att sträva efter en homogen utseende membran, som den största och mest välordnade 2D kristaller väljs visuellt för datainsamling. Dessa typer av prov kommer att vara lätt att känna igen när kristallisation försöken upprepas samt när de prover som används förCryo-EM datainsamling, vilket resulterar i ett maximalt antal högupplösta bilder.
Figur 1. Bilden visar blotting kanten av rutnätet med en sönderriven bit Whatman # 4 filterpapper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ordentlig utvärdering av prov kräver en noggrann bedömning av ett tillräckligt antal av membran. Till exempel gav prover med så låg som 2% kristallin matriser av över 180 avbildas proteoliposomes kritisk information för snabb optimering av 2D kristallisering villkor 7.
När utfällning av proteinet sker, kan ett rutnät läggas ned från ytterligare screening efter inspektion vid låg förstoring, även om enstaka delar utfällning av protein sker. Även mycket små membran på mindre än 100 nm kan ge värdefull information om ordning dock, och parametrar för att öka 2D kristall storlek kan genomföras i följande dialys experiment.
Laboratorier håller på att införa olika grader av lovande automatisering i processen med screening 8,9. Men proverna kommer fortfarande att kräva åtgärder för utvärdering och kunskap om 2D kristall storlek, morfologi, och ordning som beskrivs här. I framtiden kan det bli möjligt att analysera data av allt mindre 2D-kristaller för att högre upplösning, vilket gör dessa screening steg och de svårare utvärdering av mindre kristallina områden ännu mer kritisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar våra samarbetspartners för att ge värdefullt protein prover, vilket bidrog till några av våra metoder relaterade erfarenhet och observationer. Günther Schmalzing förutsatt vänligt möjlighet till FR att gå med detta projekt. Barbara Armbruster, Jacob Brink och Deryck Mills är tack för deras enastående hjälp och synpunkter på utrustning. Finansieringen kom från NIH bidrag HL090630.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | |||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | ||
| Micropipette and pipette tips | |||
| Whatman #4 filter paper | |||
| 1% uranyl acetate | |||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | |||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | ||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
References
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy. Methods. 41, 417-426 (2007).
- Wang, D. N., Kühlbrandt, W. High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media. J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).
- Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles. Micron. , (2010).
- Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent γ-glutamyl carboxylase. J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).
- Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 Å resolution. J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).
- Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters. J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).
- Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. Towards automated screening of two-dimensional crystals. J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).
- Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).
