乳腺上皮移植手术

Summary

本文演示了由DeOme KB开发的程序

Abstract

本文介绍和比较脂肪垫DeOme KB 等开发的清关程序 ^。1和备用程序开发布里尔 B 等 ^。2，乳腺上皮移植手术。乳腺移植手术被广泛应用于乳腺生物学家，因为它需要的事实，乳腺上皮细胞的显着发展，直到进入青春期后，不会发生的优势。在3周龄，乳腺上皮树的生长是局限于乳头附近，脂肪垫主要是缺乏对乳腺上皮细胞，但7周龄的乳腺导管上皮树延伸整个脂肪垫。因此，如果这种含有上皮细胞的脂肪垫一小部分，地区之间的乳头和淋巴结，是在3周拆除，内源性上皮永远不会填充乳腺脂肪垫，脂肪垫是描述为“清除“。这时，从其他来源的乳腺上皮可在清除脂肪垫，它有可能延长到了脂肪垫乳腺导管树木移植。利用这个程序已经在许多的实验模型，包括在转基因乳腺上皮组织的肿瘤表型^无基因型的3对整个动物的混杂影响考试，在鉴别乳腺干细胞^移植细胞有限稀释4,5的，确定增生性结节，如果进行乳腺肿瘤^6，评估前激素对乳腺上皮细胞^7,8的行为暴露的影响。

三个星期的旧主机小鼠麻醉，在手术阶段清理和克制。一个中期矢状切口，通过皮肤，但没有腹膜，从耻骨扩展到胸骨。斜削减从整个骨盆向每条腿中旬矢状切口，通过皮肤。皮肤被拉到远离腹膜暴露第四腹股沟乳腺。脂肪垫是通过消除脂肪垫组织前淋巴结清除。上皮碎片或上皮细胞移植到其余的清除脂肪垫和鼠标是封闭的。

Protocol

1。移植的上皮细胞的制备

可以移植到新鲜或冷冻的捐助上皮组织清除的脂肪垫，但事先准备的冷冻捐助上皮在移植效率的最小下降（> 85％的效率）更方便。编制冻结​​捐助上皮协议如下：

准备捐助移植上皮之前，准备冻结上皮和有关分装到冷冻管1毫升媒体。这可以保存在4 ° C，直到需要长达6个月。冻结媒体包含与HEPES和碳酸氢钠，10％胎牛血清（FBS）和10％二甲基亚砜_（DMSO）3缓冲的DMEM/F12媒体。

收获从最近安乐死的雌性小鼠乳腺上皮细胞。

1. 鼠标用70％乙醇洗涤。
2. 通过从耻骨至胸骨体延伸到墙上，没有刺耳的腹侧体腔浆膜膜中旬矢状切。从最初向每个后腿（图1）耻骨切口作出的斜剪。
3. 去皮，浆膜膜暴露5 ^日腹股沟乳腺筋膜附着在体壁的下部离体壁。最好的方式实现这一目标是通过抓一双弯钳弯曲部分的浆液膜仔细，小心不要刺破腹体腔。同时，掌握直锯齿钳包膜切缘和离体壁拉浆液膜。
4. 识别乳腺内的淋巴结。淋巴结是位于在乳腺中的三个突出的血管的交点，可以感受到作为密集的结节内脂肪垫（图2）。一双眼睛剪刀，NIP节点周围的脂肪组织的一角。随着手指上的皮肤表皮中脱颖而出，适用于压力，提高节点出的脂肪垫和一双弯钳捏。丢弃的淋巴结。
5. 虽然皮肤的边缘，掌握乳腺脂肪垫一双弯钳的弧形边缘，并逐步剥离脂肪垫离体壁。按照对背水面的鼠标，为您删除在一块整个乳腺脂肪垫的方向。
6. 放在一个无菌塑料切割块的乳腺。添加少量的媒体，约200μL，以保持湿润的腺体表面。与一个新的刀片，切碎成1毫米件的腺体。分成四个部分碎腺体和4个冷冻管钳冻结媒体之间分配。放在一个NALGENE“先生雾细胞冷冻异丙醇250毫升外舱的离心管。NALGENE冷冻在-70 ° C冰箱24小时。乳腺片段储存在液氮冷冻小瓶，直到所需的每个移植。离心管会包含足够的乳腺片段移植到清除4日至8宿主小鼠的脂肪垫。

2。移植细胞的制备

我们的实验室已移植了不同的细胞类型，包括永生化乳腺上皮细胞系，乳腺肿瘤细胞株或成鼠标的主要乳腺细胞清除脂肪垫。逗号- D细胞移植的准备协议如下：

1. 逗号- D细胞培养定期MECL媒体的DMEM：F12与2％的成年牛血清（ABS）mEGF，胰岛素，抗生素/ Antimycotic（AB / AM）补充。
2. 收获逗号D细胞，当细胞85％-90％汇合。
3. 在1200RPM离心5分钟沉淀细胞的细胞悬液。新鲜MECL媒体重悬细胞，调整细胞浓度为5 × 10 ⁶ /毫升。

对于原发性乳腺细胞的移植，主要的乳腺上皮细胞是从^小鼠乳腺5日通过机械和酶解分离。细胞是悬浮于DMEM：F12媒体和调整到所需的浓度，一般为5 × 10 ⁶ /毫升。

3。清除小鼠乳腺脂肪垫的标准程序

1. 麻醉3个星期的旧主机的鼠标。选择<12克，以确保尚未启动，乳腺导管增长的老鼠。我们使用经口200mg/kg体重2,2,2 - tribromoethanol。
2. 鼠标麻醉后，坚决抑制鼠标，腹侧，四肢伸开在手术阶段，使腹部是嘲讽。手术前，管理止痛药;布比卡因（<1mg/kg）或丁丙诺啡（0.05mg/kg），皮下注射。
3. 把握几个毫米以上骨盆钳皮肤和解除它从腹部 。聂皮肤用剪刀，并通过一个中期矢状切开从耻骨至胸骨体延伸到墙上。不要刺破腹体腔浆膜膜。不要让您的初始切口太靠近尿道，使伤口剪辑不会干扰鼠标的能力，小便。
4. 从最初的切口，通过皮肤斜削减从中线整个骨盆对每个后腿。
5. 使用弧形面积弯钳轻轻抓住浆液膜。用组织钳把握的皮肤切缘拉体壁远离浆液膜和揭露5 ^个位于体壁的下部的筋膜腹股沟乳腺。
6. 烧灼乳头，节点和两个动脉导致的节点（图2）
7. 第四和第五腺分开。烧灼第五腺的保证金，以防止从⁶日腺体长入。
8. 除以整个脂肪垫只是腹节点（对乳头侧）用剪刀切割第四乳腺脂肪垫。用弯钳，牢牢把握腹脂肪垫部分拉在一块的体壁。按腹部分的两个幻灯片之间的脂肪垫和玻璃组织学染色包含卡诺的固定液菜。该组织将与胭脂红明矾溶液后固定染色检查清除边缘（图3）。清洁弯钳乳腺脂肪垫去除所有痕迹的删除部分地区周围的筋膜。

4。另类“饶程序清除脂肪垫

后已经成为一个标准程序清除小鼠乳腺脂肪垫主管，他们可能更愿意尝试创伤小饶程序开发鲽鱼等 ^{（2008）2。}

1. 准备为标准的程序鼠标。
2. 抓住第四腹股沟乳腺乳头和乳头周围用剪刀的尖端切一个3-5毫米的圆周圈。
3. 拉出乳头，远离身体的皮肤中分离的切割部分和第四腹股沟乳腺孔通过绘制。
4. 识别节点。使用电凝烧灼的节点，并通过孔的^第 6 ^次乳腺。
5. 剪切和分离的节点之前的5 ^次乳腺最浅表的部分。乳头，皮肤和乳腺脂肪垫含有上皮部分的圆形区域，在一块被删除。

5。组织/细胞移植

1. 移植的上皮细胞碎片，除霜一个离心管上皮细胞和上皮碎片转移到培养皿中含有新鲜的媒体，以稀释的二甲基亚砜。制作了一个小洞，在清理用剪刀尖新的上皮细胞的脂肪垫或放在口袋里。放入口袋针钳的捐助上皮1毫米一块。握住组织钳封闭你退出针钳，组织到位，的口袋。
2. 移植细胞，注入10μL媒体的50,000个单元格，使用汉密尔顿一个50μL注射器用22号针头到每个脂肪垫。

6。关闭/鼠标复兴

1. 排列闭幕皮肤。抓住反对皮肤的利润率，保持他们一起用钳，电梯从腹侧体腔浆膜膜他们离开，并关闭伤口剪辑。通常情况下，有必要使用两个剪辑接近中期矢状切口和一个剪辑的标准程序的每一个斜切口。避免妨碍尿道。这可能是必要关闭在皮肤上，在中期矢状位和斜切口缝合的交集的差距。不遗余力程序将只需要一个每边的伤口剪辑。
2. 。鼠标放置在笼子里，并保持在一个加热灯笼，直到鼠标复苏。
3. 2周后应去掉伤口剪辑。

图1。切口模式的示范。

图2。淋巴结，血管，乳头和内源性上皮细胞的位置。烧灼位置表示。

图3。整装表明，内源性上皮内圆的面积限制，因此利润率“明确”。

7。代表性的成果

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图4。整装3周龄鼠标显示清除利润率从脂肪垫。

图5。整装从10周龄乳腺上皮内源性清除脂肪垫鼠标。

图6。苏木精和曙红染色部分清除从10周龄小鼠的脂肪垫。

图7：从10周龄正常乳腺导管树移植上皮鼠标整装。

图8。苏木精和曙红染色部分移植上皮开发的乳腺导管。

图9。苏木精和伊红染色部分移植上皮开发出了乳腺肿瘤。

Discussion

在这份报告中，我们提出两个替代方法，结算准备乳腺上皮移植在小鼠乳腺脂肪垫。已在使用的标准程序，自1959年发展DeOme等^。1虽然更具侵入性的，标准的方法是培训新手的首选方法，因为乳腺的结构和方向很容易观看。然而，饶程序可能会首选由更有经验的外科医生， ^因为几个优点2。最重要的是，不遗余力程序是创伤小，需要更短的时间内，可以使用吸入麻醉的短暂时期。这减少了对鼠标的恢复期。不遗余力程序也可以年轻小鼠确保成功的上皮间隙（<21天）。此外，还有一个如果实验需要重复手术切除原发肿瘤，但允许继续长期鼠标为转移的观察，这可能有利于减少手术后组织粘连。

程序的移植部分的事实，不会发生，直到进入青春期后乳腺的全面发展的优势。之前去除含有的内源性上皮细胞的脂肪垫的一小部分的“清除”的年轻老鼠的剩余脂肪垫和消除上皮导管树的发展潜力。实验上皮细胞可以移植到主机的鼠标和评估产生的副产物清除脂肪垫，可以在不混杂效应的内源性主机上皮。因此，这个过程是有用的，以评估乳腺上皮细胞的能力，在体内发展。