Summary
מאמר זה מדגים את נוהל שפותח על ידי DeOme KB
Abstract
מאמר זה מתאר ומשווה את כרית השומן אישור נוהל שפותח על ידי DeOme KB et al. 1 ו את ההליך חוסך שפותחה על ידי בריל B et al. 2, ואחריו הליך ההשתלה החלב אפיתל. הליך ההשתלה החלב נעשה שימוש נרחב על ידי ביולוגים החלב משום שהיא מנצלת את העובדה התפתחות משמעותית של האפיתל החלב אינה מתרחשת רק לאחר גיל ההתבגרות. ב 3 שבועות של גיל, צמיחה של עץ אפיתל החלב מוגבל באזור הפטמה ולוח נטול שומן ברובו של האפיתל החלב, אלא על ידי 7 שבועות של גיל העץ ductal אפיתל משתרע לאורך כרית שומן כולו. לכן, אם זה חלק קטן של כרית שומן המכילה אפיתל, האזור בין הפטמה לבין הלימפה, מוסר בשעה 3 שבועות של גיל, אפיתל אנדוגני לא יהיה לאכלס את כרית שומן החלב ולוח שומן מתואר "כחכח ". בשלב זה, אפיתל החלב ממקור אחר ניתן להשתיל בפנקס השמן פינה שבה יש פוטנציאל להרחיב עצים ductal החלב החוצה דרך כרית שומן. הליך זה נוצל במודלים ניסיוניים רבים, כולל בדיקה של פנוטיפ גידול רקמות אפיתל מהונדס החלב ללא תופעות של בלבול גנוטיפ על החיה כולה 3, בזיהוי של בתאי גזע החלב ידי השתלת תאים דילול מוגבל 4,5, קביעת אם גושים hyperplastic להמשיך גידולים החלב 6, כדי להעריך את ההשפעה של חשיפה מוקדמת ההורמון על התנהגות של האפיתל החלב 7,8.
בן שלוש בשבוע עכברים מארח מורדמים, ניקה מאופקת על הבמה כירורגי. חתך אמצע sagittal נעשית דרך העור, אך לא את הצפק, המשתרעת חיק אל עצם החזה. קיצוץ אלכסוני נעשות דרך העור מפני חתך באמצע sagittal לרוחב האגן לכיוון רגל. העור הוא התרחק הצפק לחשוף את בלוטת החלב 4 מפשעתי. כרית שומן מנוקה על ידי הסרת רקמות שומן הקדמי כרית אל הצומת לימפה. שברי אפיתל או לתאי האפיתל מושתלים לתוך כרית הנותרים פינו את השומן ואת העכבר סגור.
Protocol
1. הכנה של האפיתל להשתלות
רקמות התורם טריים או קפואים אפיתל ניתן להשתיל לתוך כרית שומן פינה, אבל הכנה מוקדמת של האפיתל תורם קפוא נוח יותר עם ירידה מזערית יעילות ההשתלה (> יעילות 85%). פרוטוקול להכנת אפיתל תורם קפוא הוא כדלקמן:
לפני הכנת השתלת אפיתל התורם, להכין התקשורת להקפיא את האפיתל ואת aliquot על 1ml לתוך cryovials. זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים עד הצורך. הקפאת התקשורת מכיל DMEM/F12 התקשורת שנאגרו עם HEPES ו NaHCO 3, 10% בסרום שור העובר (FBS) ו sulphoxide דימתיל 10% (DMSO).
קציר אפיתל החלב מן העכבר נקבה מורדמים לאחרונה.
- לשטוף את העכבר עם EtOH 70%.
- ביצוע חתך באמצע sagittal דרך הקיר הגוף המשתרעת חיק אל עצם החזה ללא חודר את הקרומים הריריים של הגוף הגחון. בצע חתך אלכסוני מן החתך הראשוני על חיק לעבר כל רגל אחורית (איור 1).
- פיל הקיר הגוף הרחק ממברנות הצפק לחשוף את בלוטת החלב 5 th מפשעתי המצורפת fascia על החלק התחתון של הקיר הגוף. הדרך הטובה ביותר להשיג זאת היא על ידי אוחז בקרום הצפק בזהירות עם החלק המעוגל של זוג מלקחיים מעוקל, נזהרים שלא לנקב את חלל הגוף הגחון. במקביל, לתפוס את הקצה של integument לחתוך ישר עם מלקחיים משוננת ולמשוך את קיר הגוף הרחק קרום הצפק.
- זהה את קשרי לימפה בתוך בלוטת החלב. קשר הלימפה ממוקמת בצומת של שלושה כלי דם בולטים בלוטת החלב וניתן הרגשתי גולה צפופה בתוך כרית השומן (איור 2). עם קצה של זוג מספריים העין, צביטה השומן הרקמה הסובבת את הצומת. עם אצבע הקדמי בצד האפידרמיס של העור, להפעיל לחץ כדי להעלות את את הצומת של כרית שומן ולצבוט אותו עם זוג מלקחיים מעוקל. מחק את הצומת לימפה.
- בעוד מחזיק את השוליים של העור, לתפוס את כרית שומן החלב עם קצה מעוגל של זוג מלקחיים מעוקל ובהדרגה לקלף כרית שומן מן הקיר הגוף. בצע את הכיוון של כרית השומן כלפי המשטח הגבי של העכבר תוך כדי להסיר את בלוטת החלב כולו בחתיכה אחת.
- שים את בלוטת החלב על גוש פלסטיק סטרילי לחיתוך. הוספת כמות קטנה של כלי התקשורת, על μl 200, על פני השטח של בלוטת כדי לשמור אותו לח. לקצץ את בלוטת לחתיכות 1mm בסכין גילוח טרי. מחלקים את בלוטת טחון לארבע מנות ולהפיץ בין ארבעה cryovials התקשורת להקפיא עם מלקחיים. שים את cryovials ב הקפאה "מר התא Nalgene פרוסטי שבה יש 250 מ"ל של אלכוהול איזופרופילי בתא החיצוני. שים את במקפיא Nalgene בתוך מקפיא -70 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. Store בקבוקונים של שברי החלב קפוא בחנקן נוזלי עד נדרש השתלה. cryovial כל יכיל שברי בלוטת החלב מספיק השתלת לתוך רפידות שומן פינה של 4 עד 8 עכברים המארח.
2. הכנת תאים להשתלות
במעבדה שלנו יש להשתיל תאים מסוגים שונים, כולל החלב קווי הנציח תא אפיתל, החלב שורות תאים סרטניים או תאים החלב הראשוני לעכבר פינה כרית שומן. פרוטוקול להכנת פסיק-D תאים להשתלה הוא כדלקמן:
- Comma-D תאים בתרבית התקשורת MECL רגיל המכיל DMEM: F12 בתוספת 2% למבוגרים שור סרום (ABS), mEGF, אינסולין, אנטיביוטי / Antimycotic (AB / PM).
- Comma-D תאים קציר כאשר התאים הם ומחוברות -90% -85%.
- צנטריפוגה ההשעיה התא 1200rpm במשך 5 דקות עד גלולה התאים. Resuspend התאים התקשורת MECL טריים להתאים את ריכוז התאים 5 x 10 6 / ml.
עבור השתלה של תאים החלב הראשוני, התאים העיקריים אפיתל החלב מבודדים מבלוטות החלב עכבר 5 th באמצעות ניתוק מכני האנזימטית. תאים הם resuspended ב DMEM: התקשורת F12 והותאמו הריכוז הרצוי, בדרך כלל 5 x 10 6 / ml.
3. הנוהל המקובל עבור ניקוי משטח עכבר שומן החלב
- להרדים את שלושת עכבר ישן שבוע המארח. בחר עכברים כי הם <12 גר 'כדי להבטיח צמיחה ductal החלב לא היה יזם. אנו משתמשים 200mg/kg ממשקל הגוף של tribromoethanol-2,2,2.
- אחרי העכבר הוא הרדים, בתוקף לרסן את העכבר, בצד הגחוני עם גפיים המושטת, על הבמה כירורגי כך הבטן היא להקניט. לפני הניתוח, לנהל משככי כאבים, או bupivacaine (1mg/kg <) או עצירות (0.05mg/kg), תת עורי.
- תפוס את העור עם מלקחיים כמה מילימטרים מעל האגן והרם אותו כלפי מעלה מהבטן . ניפ את העור עם מספריים ולעשות חתך באמצע sagittal דרך הקיר הגוף המשתרעת חיק אל עצם החזה. אין לנקב את הקרומים הריריים של הגוף הגחון. אל תעשה חתך הראשונית שלך קרוב מדי השופכה, כך קליפים הפצע לא יפריע היכולת של העכבר כדי להשתין.
- מן החתך הראשוני, לבצע חתכים אלכסוניים דרך העור מאמצע קו לרוחב האגן כלפי כל רגל אחורית.
- השתמש באזור המעוגל של מלקחיים המעוגל בעדינות כדי לתפוס את קרום הצפק. שימוש במלקחיים רקמות לתפוס את שולי חתך של העור ולמשוך את קיר הגוף הרחק ממברנות הצפק ולחשוף את בלוטת החלב 5 th מפשעתי ממוקם על fascia על החלק התחתון של הקיר הגוף.
- לצרוב, הפטמה הצומת ושני העורקים המובילים אל הצומת (איור 2)
- הפרד את בלוטות הרביעי והחמישי. לצרוב את השוליים של בלוטת החמישי כדי למנוע ingrowth מבלוטת 6 ה.
- מחלקים את כרית השומן של בלוטת החלב הרביעי של חיתוך פני כרית שומן עם מספריים רק הגחון (צד לעבר הפטמה) של הצומת. שימוש במלקחיים מעוקל כדי לתפוס בחוזקה את החלק הגחוני של כרית השומן למשוך אותו מהקיר הגוף בחתיכה אחת. לחצו על החלק הגחוני של כרית השומן בין שתי שקופיות לשים צלחת היסטולוגיה מכתים זכוכית המכיל מקבע של Carnoy. רקמה זו תהיה קבועה מוכתם לאחר מכן עם פתרון אלום ארגמן לבדוק שולי פינה (איור 3). נקו את fascia סביב האזור של החלק הסיר של כרית שומן כדי להסיר את כל עקבות של בלוטת החלב עם מלקחיים מעוקל.
4. הליך אלטרנטיבי "מתחשבת עבור ניקוי Pad שומן
אחרי אחד הפך מוכשר עם הליך סטנדרטי עבור ניקוי משטח העכבר שומן החלב, הם יעדיפו לנסות את ההליך חוסך פחות פולשני שפותח על ידי בריל et al. (2008) 2.
- הכינו את העכבר כמו בנוהל הרגיל.
- לתפוס את הפטמה של בלוטת החלב מפשעתי הרביעי וחתך 3-5 מ"מ היקף המעגל סביב הפטמה עם קצה של מספריים.
- משוך את הפטמה מהגוף לנתק את החלק לחתוך העור לצייר את בלוטת החלב fourth מפשעתי החוצה דרך החור.
- זהה את הצומת. השתמש כויה כדי לצרוב את הצומת ואת בלוטת החלב 6 th דרך החור.
- גזור לנתק את החלק השטחי ביותר של בלוטת החלב 5 th ממש לפני הצומת. , באזור הפטמה מעגלי של עור חלק משטח אפיתל החלב שומן המכיל יוסרו בחתיכה אחת.
5. רקמות / השתלת תאים
- עבור שברי אפיתל השתלה, להפשיר cryovial של האפיתל ולהעביר את שברי אפיתל כדי בצלחת פטרי המכילות מדיה טרי לדלל את DMSO. עושים חור בכיס קטן או כרית שומן פינה עם קצה מספריים עבור אפיתל חדש. שים חתיכת 1mm של האפיתל תורם לכיס עם מחט מלקחיים. החזק את כיס סגור עם מלקחיים רקמות כמו שאתה למשוך את מחט מלקחיים כך הרקמה נשארת במקומה.
- עבור תאים השתלה, להזריק 50,000 תאים μl 10 של מדיה לתוך כרית כל השומן באמצעות מזרק 50μl המילטון עם מחט מד 22s.
6. סגירת / התחייה של עכבר
- מסדרים את העור הסגירה. אחוז המתנגדים שולי העור, להחזיק אותם יחד עם מלקחיים, להרים אותם הרחק את הקרומים הריריים של הגוף הגחון ולסגור עם קליפים הפצע. בדרך כלל, יש צורך להשתמש בשני קליפים כדי לסגור את החתך באמצע sagittal קליפ אחד עבור כל חתך אלכסוני עבור ההליך הסטנדרטי. הימנע חוסם את השופכה. זה עשוי להיות נחוץ כדי לסגור פערים העור בצומת של חתכים אמצע sagittal ו אלכסונית עם תפר. ההליך חוסך רק דורשים קליפ אחד פצע לכל צד.
- . מניחים את העכבר בתוך הכלוב שלה לשמור את הכלוב תחת מנורת חימום עד העכבר מתאושש.
- קליפים הפצע יש להסיר לאחר 2 שבועות.
באיור 1. הפגנה של דפוס החתך.
איור 2. מיקום של הלימפה, כלי הדם, הפטמה אפיתל אנדוגני. לצרוב במקומות המצוין.
איור 3. הר שלם מוכיח כי אפיתל אנדוגני היא מוגבלת לאזור בתוך המעגל ולכן השוליים הם "ברור".
7. נציג תוצאות
_r.jpg "alt =" איור 4 "/>
איור 4. הר שלם של כרית השומן להסיר העכבר 3 בשבוע הישן מראה שולי פינה.
איור 5. הר שלם של העכבר בן 10 בשבוע מראה כרית שומן פינה של האפיתל החלב אנדוגני.
איור 6. Hematoxylin וסעיף eosin מוכתם של כרית שומן פינה מהעכבר 10 בשבוע הישן.
איור 7. הר שלם של העכבר בן 10 בשבוע מראה נורמלי עץ ductal החלב התפתח אפיתל המושתלים.
איור 8. Hematoxylin וסעיף eosin מוכתם של צינוריות החלב התפתח אפיתל המושתלים.
איור 9. Hematoxylin ו eosin סעיף מוכתם של גידול החלב התפתח אפיתל המושתלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדו"ח זה, אנו מציגים שתי שיטות חלופיות עבור ניקוי משטח העכבר שומן החלב לקראת השתלות אפיתל החלב. הנוהל המקובל כבר בשימוש מאז הפיתוח שלה בשנת 1959 על ידי DeOme et al. 1 בעוד פולשני יותר, השיטה המקובלת היא השיטה המועדפת להכשרת טירון כי המבנה והכיוון של בלוטת החלב נתפסים בקלות. עם זאת, ההליך חוסך עשוי להיות מועדף על ידי מנתח מנוסה יותר בשל מספר יתרונות 2. והחשוב מכל, את ההליך חוסך היא פחות פולשנית, דורש פחות זמן יכול להתבצע באמצעות תקופה קצרה של הרדמה משאיפת. פעולה זו מפחיתה את תקופת ההחלמה של העכבר. ההליך חוסך יכול גם להתבצע על עכברים צעירים (<21 ימים) הבטחת פינוי מוצלח של האפיתל. בנוסף, יש ירידה של הידבקות רקמות אחרי ניתוח אשר עשוי להיות יתרון אם הניסויים מחייבים ניתוח חוזר להסרת גידולים ראשוניים, אך לאפשר תצפית ארוכת טווח המשיכה של העכבר על גרורות.
החלק השתלת ההליך מנצלת את העובדה כי התפתחות מלאה של בלוטת החלב אינה מתרחשת רק לאחר גיל ההתבגרות. לפני הסרת החלק הקטן של כרית שומן המכיל את אפיתל אנדוגני "מנקה" את כרית השומן הנותר של העכבר הצעיר מבטלת את פוטנציאל הפיתוח של עצים ductal אפיתל. אפיתל ניסיוני ניתן להשתיל לתוך כרית שומן פינה של העכבר המארח הערכת בצמחים וכתוצאה מכך יכול להתבצע ללא תופעות בלבול של האפיתל מארח אנדוגני. לפיכך, הליך זה שימושי להערכת היכולת של תאים אפיתל החלב לפתח in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Res. 19, 515-520 (1959).
- Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).
- Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).
- Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439, 84-88 (2006).
- Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439, 993-997 (2006).
- Medina, D. Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer. Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).
- Wagner, K. -U., Boulanger, C. A., Henry, S. gagias, Hennighausen, M., Smith, G. H. L. An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal. Development. 129, 1377-1386 (2002).
- Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice. Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).
