Summary
En este artículo se muestra el procedimiento desarrollado por Enviaselo KB
Abstract
En este artículo se describe y compara el procedimiento de autorización almohadilla grasa desarrollado por Enviaselo KB et al. 1 y el procedimiento que preserve desarrollado por Brill B et al. 2, seguido por el procedimiento de trasplante epiteliales mamarias. El procedimiento de trasplante de mama es ampliamente utilizado por los biólogos de mama, ya que se aprovecha del hecho de que un importante desarrollo del epitelio mamario no ocurre hasta después de la pubertad. A las 3 semanas de edad, el crecimiento del árbol epiteliales mamarias se limita a las cercanías del pezón y la almohadilla de grasa es en gran parte desprovista de epitelio mamario, pero por 7 semanas de edad del árbol epitelio ductal se extiende a lo largo de la almohadilla de grasa total. Por lo tanto, si esta pequeña porción de la almohadilla de grasa que contiene epitelio, la región entre el pezón y los ganglios linfáticos, se retira a las 3 semanas de edad, el epitelio endógeno nunca llenarán la almohadilla de grasa mamaria y la almohadilla de grasa que se describe como "despejó ". En este momento, el epitelio mamario de otra fuente pueden ser trasplantados en la almohadilla de grasa despejado en el que tiene el potencial para extender mama ductal árboles a través de la almohadilla de grasa. Este procedimiento ha sido utilizado en muchos modelos experimentales, incluyendo el examen del fenotipo tumoral en tejidos epiteliales mamarias transgénico sin los efectos de confusión del genotipo en el animal entero 3, en la identificación de células madre mamarias mediante el trasplante de células de la dilución 4,5 limitada, la determinación de si los nódulos hiperplásicos proceder a tumores mamarios 6, y para evaluar el efecto de la exposición hormonal previo sobre el comportamiento de el epitelio mamario 7,8.
Tres semanas de edad, los ratones de acogida están anestesiados, limpia y contenida en una fase quirúrgica. Se hace una incisión sagital se realiza a través de la piel, pero no el peritoneo, que se extiende desde el pubis hasta el esternón. Cortes oblicuos se realizan a través de la piel de la incisión sagital a través de la pelvis hacia cada pierna. La piel se separa del peritoneo para exponer la cuarta glándula mamaria inguinal. La capa de grasa que se elimina mediante la eliminación de la anterior plataforma de tejido graso de los ganglios linfáticos. Fragmentos de epitelio o de las células epiteliales son trasplantadas en el resto de almohadilla de grasa y despejó el ratón está cerrado.
Protocol
1. Preparación del epitelio de Trasplantes
Donantes de tejidos frescos o congelados epiteliales pueden ser trasplantados en la almohadilla de grasa despejado, pero la preparación previa del epitelio donante congelado es más conveniente, con una mínima disminución en la eficacia del trasplante (eficiencia> 85%). El protocolo para la preparación del epitelio donante congelado es el siguiente:
Antes de preparar el epitelio de trasplantes, preparar los medios de congelación para el epitelio y la alícuota de 1 ml en crioviales. Esto se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de 6 meses hasta que sea necesario. Congelar los medios de comunicación contiene DMEM/F12 los medios de comunicación tamponado con HEPES y NaHCO 3, 10% de suero fetal bovino (SFB) y el 10% dimetilsulfóxido (DMSO).
Cosecha de epitelio mamario de una hembra de ratón recién sacrificado.
- Lavar el ratón con un 70% EtOH.
- Haga un corte sagital medio a través de la pared del cuerpo que se extiende desde el pubis hasta el esternón, sin perforar las membranas serosas de la cavidad ventral del cuerpo. Haga un corte oblicuo de la incisión inicial en el pubis hacia cada pata trasera (Figura 1).
- Pele la pared del cuerpo lejos de las membranas serosas para exponer el 5 de glándula mamaria inguinal unido a la fascia en la parte inferior de la pared del cuerpo. La mejor manera de lograrlo es comprender las membranas serosas con cuidado con la parte curva de un par de pinzas curvas, teniendo cuidado de no perforar la cavidad ventral del cuerpo. Al mismo tiempo, sujete el borde del corte de la envoltura con la pinza dentada recta y tire de la pared del cuerpo lejos de las membranas serosas.
- Identificar los ganglios linfáticos dentro de la glándula mamaria. El ganglio linfático se encuentra en la intersección de tres vasos sanguíneos prominentes en la glándula mamaria y se puede sentir como un nódulo denso dentro de la almohadilla de grasa (Figura 2). Con la punta de unas tijeras los ojos, cortar el tejido adiposo que rodea el nodo. Con un dedo índice en la parte epidérmica de la piel, aplique presión para sacar a los nodos de la capa de grasa y una pizca si fuera poco con un par de pinzas curvas. Deseche los ganglios linfáticos.
- Mientras se mantiene al margen de la piel, sujete la almohadilla de grasa mamaria con el borde curvo de un par de pinzas curvas y poco a poco la cáscara de la almohadilla de grasa de la pared del cuerpo. Siga la dirección de la almohadilla de grasa hacia la superficie dorsal del ratón como se quita toda la glándula mamaria en una sola pieza.
- Ponga la glándula mamaria en un bloque de plástico de corte estériles. Agregue una pequeña cantidad de medios de comunicación, cerca de 200 l, a la superficie de la glándula para mantenerlo húmedo. Picar la glándula en trozos de 1 mm con una cuchilla de afeitar nueva. Divide la glándula picada en cuatro partes y distribuir entre los cuatro crioviales de los medios de congelación con una pinza. Ponga el crioviales en un Nalgene "congelador de células Mr. Frosty que 250 ml de alcohol isopropílico en el compartimento exterior. Poner en el congelador Nalgene en un congelador de -70 º C durante 24 horas. Guarde los frascos congelados de fragmentos de mama en nitrógeno líquido hasta que sea necesario para trasplante. Cada criovial contendrá fragmentos de la glándula mamaria suficiente para el trasplante en las almohadillas de grasa despejado de 4 a 8 ratones de acogida.
2. Preparación de las células de Trasplantes
Nuestro laboratorio ha trasplantado diferentes tipos de células, incluyendo inmortalizado líneas de células epiteliales mamarias de mama líneas de células tumorales o células primarias de mama en un ratón despejado almohadilla de grasa. El protocolo para la preparación de Coma-D para el trasplante de células es el siguiente:
- Coma-D células se cultivan en los medios de comunicación regulares MECL contiene DMEM: F12 suplementado con Adulto 2% de suero bovino (ABS), mEGF, insulina, antibióticos / antimicóticos (AB / AM).
- Cosecha D comas las células cuando las células son un 85% -90% confluente.
- Se centrifuga la suspensión celular a 1200rpm durante 5 minutos para que sedimenten las células. Resuspender las células en los medios de comunicación fresca MECL y ajustar la concentración de células a 5 x 10 6 / ml.
Para el trasplante de células primarias de mama, la primaria de las células epiteliales mamarias están aislados de ratón 5 de las glándulas mamarias a través de la disociación mecánica y enzimática. Las células se resuspendieron en DMEM: medio F12 y se ajusta a la concentración deseada, por lo general 5 x 10 6 ml /.
3. Procedimiento estándar para la limpieza del ratón almohadilla de grasa mamaria
- Anestesiar el ratón de tres semanas de acogida de edad. Seleccione los ratones que son <12 g para asegurar que el crecimiento ductal de mama no se ha iniciado. Usamos 200mg/kg de peso corporal de 2,2,2-tribromoetanol.
- Después de que el ratón está anestesiado, con firmeza limitar el ratón, la parte ventral con las extremidades extendidas, en un tiempo quirúrgico, para que el abdomen se burla. Antes de la cirugía, administrar analgésicos, ya sea bupivacaína (1mg/kg <) o la buprenorfina (0.05mg/kg), por vía subcutánea.
- Sujete la piel con pinzas de unos pocos milímetros por encima de la pelvis y levántela desde el abdomen . Cortar la piel con unas tijeras y hacer un corte sagital medio a través de la pared del cuerpo que se extiende desde el pubis hasta el esternón. No perforar las membranas serosas de la cavidad ventral del cuerpo. No haga que su incisión inicial muy cerca de la uretra para que los clips de la herida no va a interferir con la capacidad del ratón para orinar.
- De la incisión inicial, hacer cortes oblicuos a través de la piel de la línea media a través de la pelvis hacia cada pata trasera.
- Utilice el área de la curva pinzas curvas para agarrar suavemente las membranas serosas. El uso de fórceps tejido de captar el margen de corte de la piel y tirar de la pared del cuerpo lejos de las membranas serosas y exponer el 5 de glándula mamaria inguinal situada en la fascia en la parte inferior de la pared del cuerpo.
- Cauterizar el pezón, el nodo y dos arterias que van al nodo (Figura 2)
- Separar las glándulas cuarto y quinto. Cauterizar el margen de la glándula quinto para prevenir el crecimiento interno de la glándula 6 ª.
- Divide la almohadilla de grasa de la glándula mamaria cuarto cortando a través de la almohadilla de grasa con unas tijeras sólo ventral (lado hacia el pezón) del nodo. Use pinzas curvas para agarrar firmemente la porción ventral de la almohadilla de grasa y tire de ella fuera de la pared del cuerpo en una sola pieza. Presione la parte ventral de la capa de grasa entre dos diapositivas y poner en un recipiente de vidrio de tinción histológica que contiene el fijador de Carnoy. Este tejido se fijan y se tiñen después con solución de alumbre carmín para comprobar los márgenes de borrado (Figura 3). Limpie la fascia de la región de la porción eliminada de la almohadilla de grasa a eliminar todos los rastros de la glándula mamaria con las pinzas curvas.
4. Alternativa "procedimiento que preserve para la limpieza del almohadilla de grasa
Después se ha convertido en un competente con el procedimiento estándar para limpiar el ratón almohadilla de grasa mamaria, es posible que prefieran realizar los procedimientos de preservación menos invasivo desarrollado por Brill et al. (2008) 2.
- Prepare el ratón como para el procedimiento estándar.
- Sujete el pezón de la glándula mamaria inguinal cuarto y cortar un círculo de 3-5 mm circunferencia alrededor del pezón con la punta de unas tijeras.
- Tire de la boquilla del cuerpo para separar la parte cortada de la piel y extraer la glándula mamaria inguinal cuarto por el agujero.
- Identificar el nodo. Utilice el cauterio para cauterizar el nodo y la glándula mamaria 6 º a través del agujero.
- Cortar y separar la parte más superficial de la glándula mamaria 5 º justo antes del nodo. Los pezones, la zona circular de la piel y la parte del epitelio de la almohadilla de grasa mamaria que contiene se eliminan en una sola pieza.
5. Tejido / Trasplante de células
- De los fragmentos de epitelio trasplante, descongelar un criovial del epitelio y la transferencia de los fragmentos epiteliales de una placa de Petri que contienen medio fresco para diluir el DMSO. Haz un pequeño agujero o en el bolsillo en la almohadilla de grasa despejó con la punta de tijera para el nuevo epitelio. Ponga un pedazo de 1 mm de epitelio de los donantes en el bolsillo con unas pinzas de aguja. Mantenga la bolsa cerrada con una pinza de tejidos al retirar la pinza de la aguja para que el tejido se mantiene en su lugar.
- Para las células del trasplante, las células se inyectan 50.000 en 10 l de los medios de comunicación en cada capa de grasa con una jeringa Hamilton 50μl con una aguja de calibre 22s.
6. Cierre / Revival de ratón
- Organizar la piel para el cierre. Captar los márgenes opuestos de la piel, los mantienen unidos con unas pinzas, ascensor lejos de las membranas serosas de la cavidad ventral del cuerpo y cerrar con clips de la herida. Por lo general, es necesario utilizar dos clips para cerrar la incisión sagital medio y un clip para cada incisión oblicua para el procedimiento estándar. Evitar la obstrucción de la uretra. Puede que sea necesario para cerrar las brechas en la piel en la intersección de las incisiones sagital oblicuo y con una sutura. El procedimiento que preserve sólo requerirá un clip de la herida para cada lado.
- . Coloque el ratón en su jaula y mantener la jaula con una lámpara de calentamiento hasta que el ratón ha revivido.
- Los clips de la herida debe ser retirado después de 2 semanas.
Figura 1. Demostración de patrón de incisión.
Figura 2. Ubicación de los ganglios linfáticos, los vasos sanguíneos, el pezón y el epitelio endógeno. Cauterizar en los lugares indicados.
Montaje de la figura 3. Todo demuestra que el epitelio endógeno se limita a la zona dentro del círculo y por lo tanto, los márgenes son "claras".
7. Resultados representante
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Figura 4. Todo el montaje de la almohadilla de grasa eliminado de ratón de 3 semanas de edad mostrando los márgenes de borrado.
Figura 5. Todo el montaje de un ratón de 10 semanas de edad muestran las almohadillas de grasa limpia de epitelio mamario endógeno.
Figura 6. Hematoxilina y eosina sección de una almohadilla de grasa despejado de un ratón de 10 semanas de edad.
Figura 7. Todo el montaje de un ratón de 10 semanas de edad muestren un funcionamiento normal del árbol ductal mamario desarrollado a partir de epitelio trasplantado.
Figura 8. Hematoxilina eosina y la sección de los conductos mamarios desarrollados a partir de epitelio trasplantado.
Figura 9. Hematoxilina y eosina sección de un tumor mamario desarrollado a partir de epitelio trasplantado.
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Discussion
En este informe, se presentan dos métodos alternativos para la limpieza de la almohadilla de grasa mamaria de ratón en la preparación para los trasplantes de mama epiteliales. El procedimiento estándar ha estado en uso desde su desarrollo en 1959 por Enviaselo et al. 1 Mientras más invasivo, el método estándar es el método preferido para la formación de los principiantes, porque la estructura y la orientación de la glándula mamaria son fácilmente vistos. Sin embargo, el procedimiento que preserve pueden ser preferidos por el cirujano con más experiencia debido a varias ventajas 2. Lo más importante es el procedimiento que preserve es menos invasiva, requiere menos tiempo y se puede realizar usando un breve periodo de anestesia inhalatoria. Esto reduce el período de recuperación para el ratón. El procedimiento que preserve también puede llevarse a cabo en ratones jóvenes (<21 días) mayor altura libre al éxito del epitelio. Además, hay una reducción de la adhesión del tejido después de la cirugía que puede ser ventajoso si los experimentos requieren repetir la cirugía para extirpar los tumores primarios, sin embargo, permitir la continua observación a largo plazo del ratón para la metástasis.
La parte del procedimiento de trasplante se aprovecha del hecho de que el pleno desarrollo de la glándula mamaria no se produce hasta después de la pubertad. La eliminación previa de la pequeña porción de la almohadilla de grasa que contiene el epitelio endógeno "borra" la almohadilla grasa restante de la joven ratón y elimina el potencial para el desarrollo del epitelio ductal árboles. Epitelio experimentales pueden ser trasplantados en la almohadilla de grasa de la borra del ratón de acogida y evaluación de las derivaciones resultantes pueden ser hechas sin los efectos de confusión del epitelio del huésped endógeno. Por lo tanto, este procedimiento es útil para evaluar la capacidad de las células epiteliales mamarias para desarrollar en vivo.
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