Summary
פרוטוקול זה ממחיש את הטכניקה עבור ביציות לחילוץ או בשלב מוקדם, עוברים מן oviduct מופרית של עכברים. היכולת לזהות את infindibulum והכנס מחט סוף בוטה לתוך זה הכרחי נכון לבצע את ההליך.
Abstract
נכון להיום, רק מעט מחקרים דיווחו על מניפולציות מוצלחת של העובר Peromyscus או לביולוגיה של הרבייה. יחד עם מאגר גנטי Peromyscus מרכז (http://stkctr.biol.sc.edu), אנחנו המאפיינת את ההבדלים הבולטים צורך לפתח את המערכת. המטרה העיקרית הייתה לייעל את הביצית / אחזור העובר המוקדם.
Protocol
העובר / הביצית אחזור
- לפחות שעתיים לפני שליפה של עוברים / ביציות, KSOM ממוקם 37 º C-CO 2 החממה FHM חייב להיות מופשר מ -20 °. צלחת זכוכית המכיל שלוש בארות רדודות קעור משמש טיפות הבית של KSOM בחממה. כדי למנוע התייבשות, KSOM ואת צלחת ממוקמים במכולה עפעפיים כי יש מים בתחתית. מנגנון זה מונע אידוי ללא שימוש של שמן מינרלי.
- Oviducts מן הנקבה מבייצת ממוקמים התקשורת FHM. כדי להבטיח התמצאות infindibulum שלם, קטע קטן של השחלה הוא חתך יחד עם הסעיף oviduct קטן של הרחם. מחט קהה 30 מד משמש לגרש עוברים / ביציות מן oviduct על ידי החדרת מחט לתוך infindibulum בוטה. Infindibulum יש להשתמש כדי לאחזר את העוברים מאז צינורות oviduct קטן מדי עבור מחט לעבור. במקרה infindibulum נהרס, oviduct חייב להיות פרוס או פתוח או עוברים סחט.
- עוברים / ביציות נמצאים בתקשורת FHM ידי התמקדות מיקרוסקופ על טיפות שומן אשר שקעו לתחתית צלחת פטרי. העובר / בידוד הביצית יכולה להיות מושגת על 20x כמו זה מספק שטח צפייה גדול יותר בהגדלה גבוהה. העובר / ביציות נראים כמו טיפות שומן עגול, כי יש טבעת ברור סביבו. Pipetting הפה, בעזרת כוס משך נימי, משמש להעברת עוברים / ביציות כדי KSOM עבור הדגירה ומניפולציה נוספת.
נוהל אחזור הביצית
הכנה
- הפשירי FHM ולהכין kSOM.
- כמה שעות קודם לכן, kSOM מקום בתוך מכולה ביצה אחזור ומקום בתיבת טיפ עם מים בתחתית, מקום CO 2 באינקובטור.
- מביאים כלובים למעבדה להרוג את הנקבות קציר.
- חותכים את oviduct נזהר לחתוך חלק השחלה וחלק של הרחם כדי לוודא שאתה לא כורתים חלק oviduct.
- מקום בתקשורת FHM בצלחת פטרי קטנות.
- יוצקים כמה FHM יותר בתקשורת צלחות פטרי לשמש שטיפה.
הסמקה
- שימוש במחט שטיפה (30 מד בוטה) מחובר מחט 1ml עם סוף ספירלה.
- קח אחד oviduct בכל פעם, באמצעות מחט, להכניס לתוך משפך נמצא ליד החלק של השחלה השמאלית מחוברת. אם משפך הוא נהרס ולא ניתן להשתמש בו, ואז לקחת שני מלקחיים והחזק קצה אחד של oviduct. עם המלקחיים השני, ללחוץ בעדינות, כמו שפופרת משחת שיניים, כדי להוציא כל העובר של.
הערה: פעולה זו תיצור כמות גדולה של בלגן בצלחת פטרי, כמו הרבה רקמות יבוא עם זה, ולכן מומלץ להשתמש בצלחת פטרי שונה לאחר מכן.
- כדי לראות את העוברים, להתמקד מיקרוסקופ על פיסות שומן לחפש "חתיכת שומן" עגול עם עיגול מסביב זה ברור.
הערה: יש העוברים את המראה כמו השומן, כך שהוא עשוי להיות קשה למצוא. עוברים לשקוע לתחתית, כך נראה שם.
- האם מריחות הנרתיק של נקבות הנמען. בשלב זה, הם צריכים להיות pseudopregnant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה, אנחנו מדגימים שליפה של ביציות מן הביוץ המושרה (superovulated) Peromyscus. השימוש superovulation (לעומת מחזור הייחום טבעי) נפוץ בשל המספרים וכתוצאה מכך הרבה יותר. עם זאת, זהירות יש לנקוט בפרשנות התוצאות ניצול כזה ביציות / עוברים, כמו גם בשימוש בהורמונים כדי לגרום הביוץ culturing עשויה להיות השפעה.
כאשר הייחום אושרה, הנקבות הן euthenized ו oviducts התאושש יחד עם חלק קטן של השחלה. אזור קטן של השחלה משמש כסמן לגבי מיקומו של infindibulum. Infindibulum יושב ליד השחלה, לעתים קרובות פעמים מקרין באמצעות שכבה דקה של רקמה. בצד השני של רקמה זו, שאר oviduct הוא מפותל והוא מוביל בסופו של דבר לתוך הנרתיק. עדיף לדחוף נוזלים דרך infindibulum כדי לחלץ את ביציות. בכיוון זה נחוץ עקב שסתום חד דרך הממוקם ממשק הנרתיק-oviduct. ביציות עלול להיפגע אם הם מוקרנים לאחור דרך שסתום.
מחט 30-gaugle סוף בוטה מוכנס לתוך infindibulum. מחט סוף בוטה יתאים הפתיחה infindibulum, אבל לא משתלבים בצינור oviduct. לכן, יש להקפיד על מנת להבטיח את infindibulum אינו פגום במהלך דיסקציה או אחזור הביצית. אם infindibulum פגום, צנרת oviduct יכול להתמצות באמצעות מלקחיים כדי לאפשר לכל ביציות לכודים כדי לצאת.
בהנחה הנשי היה הייחום, איברי הרבייה תהיה הופעה אדום בשל אספקת דם מוגברת מראה נפוח. ראינו הבדלים בין שני המינים עכבר צבי נבדק: פ polionotus היה השחלות הרבה fattier ו oviducts מ פ maniculatus, מה שהופך אחזור הביצית קשה יותר.
לאחר ביציות יש להסיר oviduct, הם עשויים להיות שנצפו על ידי במיקרוסקופ אור בהגדלה נמוכה. הצגת ביציות בהגדלה נמוכה מאפשרת למשתמש לסרוק את צלחת פטרי במהירות. מיקרוסקופ צריך להיות ממוקד על השכבה התחתונה של גרגרי שומן. ביציות ייראו גרגרי שומן סיבוב מושלם עם טבעת ברור סביב מבחוץ. כדי לסייע באיתור ביציות, נסה לשנות את הקרנת אור דרך צלחת פטרי. בנוסף, ביציות אם צלחת פטרי הוא מזועזע קלות לא יזוז לעומת טיפות שומן. רמזים אלו עשויים לעזור חוקר טירון כדי לאתר את ביציות, אולם סביר להניח כי מספר ניסויים יהיה צורך לפני אחד הוא מרגיש בנוח עם ההליך.
ביציות מבודדים ניתן להשתמש במגוון של ניסויים, כולל ייצור של שורות תאים גזע, ייצור של מפלצות, או מניפולציות גנטיות. אמנם מצאנו הבדלים ניכרים בפרמטרים והעיתוי נדרש כדי לגרום לביוץ, טכניקות כלליות אחזור צריך לחול על מינים רבים מכרסמים (עכברים צבי הם ~ 30 מיליון שנים התפצלו משני עכברי מעבדה וחולדות). אנו מקווים כי זה במיוחד ייהנו העובדים במערכות רומן שבו טכניקות כאלה אינם מבוססים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אני רוצה להודות מייק דיואי ממרכז במלאי Peromyscus הגנטי על הסבלנות שלו, עזרה וידע.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Flushing needle | Tool | Zephyrtronics | ZT5-130-L | 30 G blunt |
| Forceps (2) | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5060 | |
| Peromyscus | Animal | Peromyscus Genetic Stock Center | ||
| Scissors | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
| FHM HEPES Buffered Media | Reagent | Specialty Media | MR-025-d | |
| KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL) | Reagent | Specialty Media | MR-020P-5F | |
| Mouth Pipette | Tool | Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing | ||
| Oocyte holding dish | Tool | Glass container with concave divets |
