Восстановление мыши ооцитов

Summary

Этот протокол иллюстрирует технику для извлечения яйцеклеток или на ранней стадии оплодотворения эмбрионы из яйцевода мышей. Способность идентифицировать infindibulum и вставьте тупой иглой в конце важно правильно выполнять процедуры.

Abstract

На сегодняшний день только несколько исследований сообщили об успешном проведении манипуляций Реготузсиз эмбриогенеза или репродуктивной биологии. Вместе с Реготузсиз генетического фонда Центр (http://stkctr.biol.sc.edu), мы характеризующие основные различия, необходимые для разработки этой системы. Основной задачей было оптимизировать ооцитов / начале поиска эмбриона.

Protocol

Эмбрионов / ооцитов поиска

1. По крайней мере, за два часа до извлечения эмбрионов / ооцитов, KSOM находится в 37 ° C CO ₂ инкубатора и FHM должна быть талой с ° -20. Стеклянную посуду, содержащие три вогнутые неглубоких скважин используется для дома капель KSOM в инкубаторе. Чтобы избежать обезвоживания, KSOM и блюда помещаются в контейнер закрытой крышкой, что есть вода на дне. Этот аппарат предотвращает испарение без использования минерального масла.
   
   
2. Яйцеводы от овуляции женщины размещаются в средствах массовой информации FHM. Для обеспечения ориентации и нетронутыми infindibulum, небольшая часть яичника вырезать вместе с яйцевода и небольшого участка матки. Тупой 30 иглы используется изгнать эмбрионов / ооцитов из яйцевода, вставив тупой иглой в infindibulum. Infindibulum должен быть использован для получения эмбрионов с яйцевода трубы слишком мал для иглу, чтобы пройти. В том случае, infindibulum разрушен, яйцевод должны быть либо открытыми нарезанный или эмбрионов выдавливается.
   
   
3. Эмбрионы / ооциты находятся в СМИ FHM, сосредоточив внимание на микроскоп капелек жира, которые опустились на дно чашки Петри. Эмбрионов / ооцитов изоляции может быть достигнуто при 20x, поскольку это обеспечивает большую область просмотра, чем большим увеличением. Эмбрионов / ооцитов выглядеть круглых капелек жира, которые имеют четкую кольцо вокруг него. Пипетирование ртом, используя вытащил стеклянный капилляр, используется для перемещения эмбрионов / ооцитов к KSOM для инкубации и дальнейшей манипуляции.

Процедура извлечения ооцитов

Подготовка

1. Оттепель FHM и подготовить kSOM.
2. Несколькими часами ранее, место kSOM в яйце контейнер поиска и место в совете ящик с водой на дне, месте в CO ₂ инкубаторе.
3. Принесите клетки в лабораторию и уничтожить уборки женщин.
4. Вырежьте яйцевода будьте осторожны, чтобы сократить некоторые из яичника и некоторые из матки, чтобы вы не отрезали часть яйцевода.
5. Место в FHM СМИ в небольших чашках Петри.
6. Налейте еще пару FHM СМИ чашки Петри, которые будут использоваться для промывки.

Промывка

1. Использование промывки иглы (30 калибр тупой), подключенных к 1 мл иглой со спиральной конца.
2. Возьмите один яйцевод в то время, и с помощью иглы, вставить в воронки около часть яичника левого прилагается. Если воронки разрушается и не может быть использована, а затем взять два щипцы и держите один конец яйцевода. С другой forcep, слегка сжать, как зубная паста трубки, чтобы извлечь какой-либо эмбриона.
   
   Примечание: Это создаст большое количество беспорядок в чашке Петри, как много ткани придет с ним, так что вы можете использовать другой чашке Петри после этого.
   
   
3. Чтобы увидеть эмбрионы, фокус микроскопа на жире кусочки и выглядят для круглых "кусок жира" с четким кругом вокруг него.
   
   Примечание: эмбрионы имеют тот же вид, как жир, так что может быть трудно найти. Эмбрионов опускаются на дно, так что смотрите там.
   
   
4. У вагинальных мазках получателя женщин. На этом этапе, они должны быть псевдобеременным.

Discussion

В этой статье мы покажем извлечения ооцитов от овуляции-индуцированного (superovulated) Реготузсиз. Использование суперовуляции (в отличие от природных эстрального цикла) является общим в связи с гораздо большей полученные числа. Тем не менее, осторожность должны быть приняты в интерпретации результатов использования таких яйцеклеток / эмбрионов, так как и гормонов, используемых, чтобы вызвать овуляцию и культивирования может оказывать действие.

Когда эстрального было подтверждено, женщины euthenized и яйцеводы восстановления наряду с небольшой части яичника. Небольшой области яичников используется в качестве маркера для расположения infindibulum. Infindibulum сидит рядом с яичником, зачастую выступающих через тонкий слой ткани. На другой стороне этой ткани, остальная часть яйцевода свернута и в конечном итоге приводит во влагалище. Лучше всего, чтобы подтолкнуть жидкости через infindibulum для извлечения ооцитов. Это направление необходимо в связи с в одну сторону клапан, расположенный на влагалище-яйцевода интерфейс. Ооцитов может быть причинен вред, если они проецируются назад через клапан.

30-gaugle тупой иглой конце вставляется в infindibulum. Тупой конец стрелки будет соответствовать infindibulum открытия, но не будет вписываться в яйцевод труб. Поэтому, необходимо позаботиться, чтобы обеспечить infindibulum не поврежден во время диссекции или извлечения ооцитов. Если infindibulum поврежден, яйцевод трубки могут быть сжаты с помощью щипцов, чтобы позволить любому ловушке ооцитов, чтобы выйти.

Предполагая, женщина была в эстрального, репродуктивные органы будут иметь красный появление из-за увеличения кровоснабжения и появляются опухшие. Мы наблюдали различия в двух видов оленей мыши испытания: П. polionotus было гораздо жирнее яичники и маточные трубы, чем Р. татсиШиз, что делает извлечения ооцитов сложнее.

После ооцитов сняли с яйцевода, они могут наблюдаться с помощью световой микроскопии при малом увеличении. Просмотр ооцитов при меньшем увеличении позволяет пользователю сканировать чашке Петри быстро. Микроскопа должно быть сосредоточено на нижний слой жира гранулы. Ооцитов будет выглядеть идеально круглой жира гранулы с ясным кольцо вокруг снаружи. Чтобы помочь в обнаружении ооцитов, попробуйте отрегулировать огонь, излучающий через чашку Петри. Кроме того, если чашке Петри слегка потряс ооцитов не будет двигаться по сравнению с капелек жира. Эти советы могут помочь начинающему исследователю, чтобы найти ооцитов, однако вполне вероятно, что несколько судебных процессов будет необходима прежде чем устраивает процедура.

Изолированных ооцитов могут быть использованы в различных экспериментов, включая производство линий стволовых клеток, производству химер, или генетических манипуляций. Хотя мы обнаружили значительные различия в параметрах и сроках требуется, чтобы вызвать овуляцию, общие методы для поиска должна быть применима для многих видов грызунов (мышей оленей составляют ~ 30 млн лет разошлись с двух лабораторных мышей и крыс). Мы особенно надеемся, что это пойдет на пользу тех, кто работает в романе системах, где такие методы не укоренилась.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Flushing needle	Tool	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G blunt
Forceps (2)	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Peromyscus	Animal	Peromyscus Genetic Stock Center
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
FHM HEPES Buffered Media	Reagent	Specialty Media	MR-025-d
KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL)	Reagent	Specialty Media	MR-020P-5F
Mouth Pipette	Tool			Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing
Oocyte holding dish	Tool			Glass container with concave divets