Fare Oosit alımı

Summary

Bu protokol, farelerde yumurtalık açılan oosit ve erken evre döllenmiş embriyolar tekniği göstermektedir. Infindibulum belirlemek ve künt bir sonu iğne içine girmek için doğru işlemi gerçekleştirmeden yeteneği esastır.

Abstract

Bugüne kadar, sadece birkaç çalışma Peromyscus embriyogenez veya üreme biyolojisi başarılı manipülasyonlar bildirdin. Peromyscus Genetik Stock Merkezi (http://stkctr.biol.sc.edu) ile birlikte, biz bu sistemi geliştirmek için gerekli belirgin farklılıklar karakterize edilir. Oosit / erken embriyo alma optimize etmek için öncelikli bir hedef olmuştur.

Protocol

Embriyo / Oosit alımı

1. Embriyolar / oosit alımı öncesinde en az iki saat, 37 º C CO ₂ kuvöz ve FHM KSOM yerleştirilir -20 ° çözülmüş olmalıdır. Üç içbükey sığ kuyulardan içeren bir cam tabak inkübatör KSOM ev damla kullanılır. Dehidratasyonu önlemek için, KSOM ve çanak alt kısmında su kapaklı bir kap konur. Bu cihaz, madeni yağ kullanılmadan buharlaşmasını önler.
   
   
2. Yumurtladığımı kadın siyon hatası FHM medya yerleştirilir. Yönelim ve sağlam bir infindibulum sağlamak için, bir yumurtalık, rahim, yumurtalık ve küçük bir bölümü ile birlikte küçük bir bölümü kesilir. Künt 30 iğne künt iğne infindibulum içine sokarak yumurtalık embriyolar / oosit dışarı atmak için kullanılır. Yumurtalık boru geçirmek için bir iğne için çok küçük olduğundan infindibulum embriyolar almak için kullanılması gerekir. Infindibulum tahrip olması halinde, yumurtalık ya da açık dilimlenmiş veya embriyolar sıkılmış olmalıdır.
   
   
3. Embriyolar / oosit Mikroskop Petri kabı dibine batırdı yağ damlacıkları üzerine odaklanarak FHM medya bulundu. Bu, yüksek büyütme daha geniş bir görüş alanı sağlar olarak embriyo / oosit izolasyonu 20x elde edilebilir. Embriyo / oosit çevresinde açık bir halka var yuvarlak yağ damlacıkları gibi görünüyorsun. Çekilmiş bir cam kapiller kullanarak Ağız pipetleme, kuluçka ve daha fazla manipülasyon için KSOM embriyo / oosit taşımak için kullanılır.

Oosit Alma Usulü

Hazırlık

1. FHM çözülme ve kSOM hazırlamak.
2. Birkaç saat önce, yer altındaki su ile ucu kutusu, CO ₂ kuvöz yerine yumurta kabı ve yeri kSOM.
3. Laboratuara kafesleri getirin ve hasat kadın öldürmek.
4. Yumurtalık yumurtalık parçası kesilmiş olmadığını sağlamak için bazı yumurtalık ve rahim kesmek için dikkatli olmak Kes.
5. Küçük Petri kabındaki FHM medya yerleştirin.
6. Ateş basması için kullanılan bir çift daha FHM medya Petri kutularına dökün.

Flushing

1. Spiral ucu ile bir 1ml iğne bağlanan bir kızarma iğne (30 ölçer künt) kullanın.
2. Yumurtalık parçası takılı kalmış yanında bulundu infundibulum takın, bir yumurtalık, bir zaman ve iğne kullanarak çekin. Infundibulum yok ve olamaz, daha sonra iki forseps almak ve Boruların bir ucundan tutun. Diğer forsepsle ile hafifçe herhangi bir embriyonun çıkarmak için, bir diş macunu tüpü gibi sıkmak.
   
   Not: Bu, bir çok doku ile gelecek büyük miktarda Petri kabındaki karışıklık yaratacak, böylece daha sonra farklı bir Petri kabı kullanmak isteyebilirsiniz .
   
   
3. , Embriyoların mikroskop yağ parçaları üzerinde odak ve net bir daire ile etrafında yuvarlak "yağ parçası" aramak için.
   
   Not: embriyolar yağ olarak aynı görünüme sahip, bu yüzden bulmak zor olabilir. Embriyolar dibine çöker, bu nedenle orada bak.
   
   
4. Alıcı kadın vajinal smear yapın. Bu aşamada, pseudopregnant olmalıdır.

Discussion

Bu makalede, yumurtlama indüklenen (süperovulasyon) Peromyscus oosit alma göstermektedir. Süperovulasyon (doğal östrus döngüsü karşı) kullanımı nedeniyle çok daha fazla çıkan numaraları yaygındır. Ancak, yumurtlama ve kültür ikna etmek için kullanılan hormonlar etkileri olabilir, bu oosit / embriyoların kullanarak sonuçları yorumlanırken dikkatli alınmalıdır.

Östrus onaylandığı zaman, kadınlarda euthenized ve siyon hatası yumurtalık küçük bir bölümünü birlikte kurtarıldı. Over küçük bir bölgenin infindibulum konumu için bir belirteç olarak kullanılır. Infindibulum çoğu kez doku ince bir tabaka ile projelendirme, yumurtalık yanında oturuyor. Diğer taraftan bu doku, yumurtalık geri kalanı sarılmış ve sonunda vajina içine açar. Oosit ayıklamak için infindibulum yoluyla sıvı itmek için en iyisidir. Bu yönü nedeniyle vajina yumurtalık arayüzünde bulunan tek yönlü vana için gerekli. Valfi üzerinden geriye doğru tahmin edilmektedir oosit zarar verebilir.

30 gaugle künt uçlu iğne infindibulum eklenir. Künt sonunda iğne infindibulum açılış uyacak, ancak yumurtalık boru içine sığmaz. Bu nedenle, infindibulum diseksiyon veya oosit sırasında zarar görmediğinden emin olmak için dikkat edilmelidir. Infindibulum bozuksa sıkışan oosit çıkmak için izin vermek, yumurtalık boru forseps aracılığıyla sıkılmış olabilir.

Kadın varsayarsak östrus, üreme organları, artan kan akımı nedeniyle kırmızı bir görünümü var ve şiş görünür. P. polionotus P. maniculatus daha çok yağlıdır yumurtalıklar ve siyon hatası vardı, oosit daha zor hale getirmek: Biz iki geyik fare türlerinde farklılıklar test gözlemlenmiştir.

Oosit yumurtalık kaldırıldıktan sonra, onlar düşük büyütmede ışık mikroskobu ile görülebilir. Daha düşük bir büyütme oosit görüntüleme, kullanıcının hızlı Petri kabı taramasına olanak verir. Mikroskop alt tabaka yağ granülleri odaklı olmalıdır. Oosit dışında çevresinde açık bir halka ile mükemmel yuvarlak yağ granülleri gibi bakacağız. Oosit tespit etmede yardımcı olmak için, Petri kabı ile projelendirme ışık ayarlamaya çalışın. Buna ek olarak, Petri kabı hafifçe çalkalanır oosit yağ damlacıkları göre hareket olacaktır. Bu ipuçları, acemi araştırmacı oosit bulmak için yardımcı olabilir, fakat bir prosedür ile rahat birkaç denemeden önce gerekli olacağı muhtemeldir.

Izole oosit kök hücre hatları, kimeralar üretim, ya da genetik manipülasyonlar üretimi de dahil olmak üzere çeşitli deneyler kullanılmış olabilir. Ovulasyonu için gerekli parametreleri ve zamanlama önemli farklılıklar olsa da genel teknikleri, geri almak için birçok kemirgen türleri (geyik fareler, hem de laboratuvar fare ve sıçanlar uzaklaşmıştır ~ 30 milyon yıl) için geçerli olmalıdır. Biz özellikle bu yeni sistemlerde bu tür teknikler köklü değildir çalışanların yararına olacağını umutluyuz.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Flushing needle	Tool	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G blunt
Forceps (2)	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Peromyscus	Animal	Peromyscus Genetic Stock Center
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
FHM HEPES Buffered Media	Reagent	Specialty Media	MR-025-d
KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL)	Reagent	Specialty Media	MR-020P-5F
Mouth Pipette	Tool			Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing
Oocyte holding dish	Tool			Glass container with concave divets