Ophalen van Muis Eicellen

Summary

Dit protocol laat de techniek voor de extractie van eicellen of een vroeg stadium bevrucht embryo uit de eileider van muizen. De mogelijkheid om de infindibulum identificeren en steek een stomp uiteinde naald in is het essentieel om de juiste uitvoering van de procedure.

Abstract

Tot op heden hebben slechts een paar studies met succes manipulaties van Peromyscus embryogenese of reproductieve biologie. Samen met de Peromyscus Genetische Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), zijn wij het karakteriseren van de meest opvallende verschillen die nodig is om dit systeem te ontwikkelen. Een primaire doel is geweest om eicel / vroege embryo ophalen optimaliseren.

Protocol

Embryo / Ovumaspiratie

1. Ten minste twee uur voor het ophalen van embryo's / eicellen, KSOM wordt geplaatst in de 37 º C CO ₂ incubator en FHM moeten worden ontdooid van -20 °. Een glazen schaal met drie concave ondiepe putten wordt gebruikt naar het huis van druppels KSOM in de incubator. Om uitdroging te voorkomen, zijn de KSOM en schotel geplaatst in een container met deksel dat water is aan de onderkant. Dit apparaat voorkomt verdamping zonder het gebruik van minerale olie.
   
   
2. De eileiders van een eisprong vrouwen zijn geplaatst in FHM media. Om ervoor te zorgen oriëntatie en een intact infindibulum, is een klein deel van de eierstok snijden samen met de eileider en het klein deel van de baarmoeder. Een stompe naald van 30 gauge wordt gebruikt om embryo's / eicellen uit de eileider te verdrijven door het invoegen van de stompe naald in de infindibulum. De infindibulum moet worden gebruikt om de embryo's te halen, omdat de eileider buis is te klein voor een naald te passeren. In het geval dat de infindibulum wordt vernietigd, moet de eileider ofwel worden opengesneden of embryo's uitgeperst.
   
   
3. Embryo's / eicellen zijn gevonden in de FHM media door zich te richten de microscoop op de vetdruppeltjes die gezonken naar de bodem van de petrischaal. Embryo / eicel isolatie kan worden bereikt op 20x, omdat dit zorgt voor een grotere kijkhoek biedt dan een hoge vergrotingsfactor. Embryo / eicellen eruit ronde dikke druppels die een duidelijke ring rond hebben. Pipetteren met de mond, met behulp van een getrokken glazen capillaire, wordt gebruikt om embryo's / eicellen te verplaatsen naar KSOM voor incubatie en verdere manipulatie.

Procedure voor Ovumaspiratie

Voorbereiding

1. Dooi FHM en voor te bereiden kSOM.
2. Een paar uur eerder plaats kSOM in ei ophalen container en plaats in top box met water in de bodem, plaats in de CO ₂ incubator.
3. Breng kooien naar het lab en dood de oogst vrouwtjes.
4. Knip de eileider voorzichtig om een ​​deel van de eierstok en een deel van de baarmoeder gesneden om ervoor te zorgen dat je niet afgesneden deel van de eileider.
5. Plaats in FHM media in kleine petrischaal.
6. Giet een paar FHM media petrischalen om te worden gebruikt voor het spoelen.

Vlissingen

1. Gebruik een flushing naald (30 gauge stomp) aangesloten op een 1ml naald met spiraal te beëindigen.
2. Neem een ​​eileider in een tijd en het gebruik van de naald, in te voegen in infundibulum gevonden in de buurt het deel van eierstokken laat zitten. Als het infundibulum wordt vernietigd en kan niet worden gebruikt, neem dan twee tangen en houd een uiteinde van eileider. Met de andere pincet, zachtjes, knijp net als een tube tandpasta, aan een embryo's uit te werpen.
   
   Opmerking: Dit zal een grote hoeveelheid rommel in de petrischaal te creëren, aangezien veel van weefsel zal komen met, dus wilt u misschien een andere petrischaal nadien te gebruiken.
   
   
3. Om embryo's te zien, focus microscoop op vet stukken en kijk voor ronde "vet stuk 'met een duidelijke cirkel er omheen.
   
   Opmerking: De embryo's hebben dezelfde look als het vet, dus het kan moeilijk te vinden zijn. De embryo's zinken naar de bodem, dus er kijken.
   
   
4. Doe vaginale uitstrijkjes van de ontvanger vrouwen. In dit stadium, moeten ze worden pseudo.

Discussion

In dit artikel tonen we het ophalen van eicellen van ovulatie-geïnduceerde (gesuperovuleerde) Peromyscus. Het gebruik van superovulatie (in tegenstelling tot natuurlijke oestrische cyclus) is vaak te wijten aan de veel grotere aantallen als gevolg. Voorzichtigheid moet echter worden genomen bij het interpreteren van resultaten gebruik te maken van zulke eicellen / embryo's, omdat zowel de hormonen worden gebruikt om de ovulatie en het kweken induceren, kunnen effecten hebben.

Wanneer oestrische is bevestigd, zijn vrouwen euthenized en eileiders hersteld samen met een klein deel van de eierstok. De kleine regio van de eierstok wordt gebruikt als een marker voor de locatie van de infindibulum. De infindibulum zit naast de eierstokken, vaak tijden projecteren door middel van een dun laagje weefsel. Aan de andere kant van dit weefsel wordt de rest van de eileider opgerold en uiteindelijk leidt naar de vagina. Het beste is om vloeistof door te zetten de infindibulum om de eicellen te extraheren. Deze richting is noodzakelijk te wijten aan een enkele klep gelegen aan de vagina-eileider-interface. De eicellen kunnen worden geschaad als ze achteruit geprojecteerd door de klep.

Een 30-gaugle stompe einde naald wordt ingevoegd in de infindibulum. De stompe einde naald past de infindibulum opening, maar past niet in de eileider slang. Daarom moet zorg worden genomen om te zorgen voor de infindibulum is niet beschadigd tijdens de dissectie of eicel ophalen. Als het infindibulum beschadigd is, kan de eileider buizen worden geperst via tang om er opgesloten eicellen om af te sluiten.

Ervan uitgaande dat de vrouwelijke was in oestrische, zal de voortplantingsorganen hebben een rode uitstraling als gevolg van verhoogde bloedtoevoer en lijken gezwollen. We waargenomen verschillen in de twee herten muis geteste soorten: P. polionotus had veel vetter eierstokken en eileiders dan P. maniculatus, waardoor Ovumaspiratie moeilijker.

Zodra de eicellen zijn verwijderd uit de eileider, kunnen ze worden waargenomen door middel van lichtmicroscopie bij een lage vergroting. Het bekijken van de eicellen met een lagere vergroting kan de gebruiker de petrischaal snel scannen. De microscoop moet gericht zijn op de onderste laag van vet korrels. De eicellen zal er zo uitzien perfect ronde dikke korrels met een duidelijke ring rond de buitenkant. Om te helpen bij het opsporen van de eicellen, probeer het licht te projecteren door middel van de petrischaal. Daarnaast zal, indien de petrischaal is licht geschud eicellen niet bewegen ten opzichte van de vetdruppeltjes. Deze tips kunnen helpen de beginnende onderzoeker om de eicellen te lokaliseren, maar is het waarschijnlijk dat een aantal proeven nodig zijn voordat men comfortabel met de procedure.

De geïsoleerde eicellen mogen worden gebruikt in een verscheidenheid van experimenten inclusief de productie van stamcellijnen, de productie van chimaeren, of genetische manipulaties. Hoewel we hebben gevonden een aanzienlijke variatie in de parameters en timing nodig is om de ovulatie te induceren, moet de algemene technieken voor het ophalen van toepassing op vele soorten knaagdieren (herten muizen zijn ~ 30 miljoen jaar afweken van zowel de laboratorium-muizen en ratten). Wij zijn bijzonder hoopvol dat dit zal degenen die werken in nieuwe systemen waar dergelijke technieken niet goed-vastgestelde baten.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Flushing needle	Tool	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G blunt
Forceps (2)	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Peromyscus	Animal	Peromyscus Genetic Stock Center
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
FHM HEPES Buffered Media	Reagent	Specialty Media	MR-025-d
KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL)	Reagent	Specialty Media	MR-020P-5F
Mouth Pipette	Tool			Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing
Oocyte holding dish	Tool			Glass container with concave divets