Récupération des ovocytes de souris

Summary

Ce protocole illustre la technique d'extraction ou d'ovocytes à un stade précoce des embryons fertilisés de l'oviducte de la souris. La capacité à identifier les infindibulum et insérer une aiguille extrémité émoussée en elle est essentielle à l'exécution correcte de la procédure.

Abstract

À ce jour, seules quelques études ont rapporté des manipulations de succès de l'embryogenèse Peromyscus ou biologie reproductive. En collaboration avec le Centre de Peromyscus stock génétique (http://stkctr.biol.sc.edu), nous caractérisons les différences saillantes nécessaires pour développer ce système. Un premier objectif a été d'optimiser ovocyte / récupération précoce de l'embryon.

Protocol

Embryon / ovocytes de récupération

1. Au moins deux heures avant le prélèvement des ovocytes / embryons, KSOM est placé dans les 37 º C incubateur à CO ₂ et FHM doivent être décongelés à partir de -20 °. Un plat en verre contenant trois concaves puits peu profonds sont utilisés à des gouttes maison de KSOM dans l'incubateur. Pour prévenir la déshydratation, l'KSOM et le plat sont placés dans un conteneur à couvercle qui a l'eau au fond. Cet appareil empêche l'évaporation sans l'utilisation d'huile minérale.
   
   
2. Les oviductes d'une femelle ovulation sont placées dans les médias FHM. Pour assurer l'orientation et une infindibulum intacte, une petite section de l'ovaire est coupé avec la section oviducte et petits de l'utérus. Une aiguille de calibre 30 émoussée est utilisée pour expulser ovocytes / embryons de l'oviducte en insérant l'aiguille émoussée dans le infindibulum. Le infindibulum doit être utilisée pour récupérer les embryons depuis le tube oviducte est trop petit pour une aiguille à passer. Dans le cas où l'infindibulum est détruit, l'oviducte doit être soit éventrés ou des embryons évincés.
   
   
3. Ovocytes / embryons sont trouvés dans les médias FHM en concentrant le microscope sur les gouttelettes de graisse qui ont coulé au fond de la boîte de Pétri. Embryon / ovocyte isolement peut être réalisé à 20x car cela offre une plus grande surface de visionnement que fort grossissement. Embryon / ovocytes ressemblent rondes gouttelettes de graisse qui ont un anneau clair autour de lui. Pipetage à la bouche, en utilisant un verre tiré capillaire, est utilisé pour déplacer ovocytes / embryons d'KSOM d'incubation et de manipulations ultérieures.

Procédure de récupération d'ovocytes

Préparation

1. Dégel FHM et préparer kSOM.
2. Quelques heures plus tôt, kSOM placer dans un récipient de récupération d'œuf et placer dans la boîte de la pointe avec de l'eau dans le fond, placer en incubateur à CO _2.
3. Apportez des cages au laboratoire et de tuer les femelles récolte.
4. Découpez l'oviducte en prenant soin de couper une partie de l'ovaire et certains de l'utérus pour s'assurer que vous ne coupez pas partie de l'oviducte.
5. Placer dans les médias FHM en petite boîte de Petri.
6. Verser un couple plus FHM médias boîtes de Pétri à être utilisé pour le rinçage.

Flushing

1. Utiliser une aiguille de rinçage (30 émoussée jauge) connecté à une aiguille à bout 1ml spirale.
2. Prendre un oviducte à la fois et en utilisant l'aiguille, insérez-le dans infundibulum trouvé près de la partie de l'ovaire gauche ci-joint. Si l'infundibulum est détruit et ne peut pas être utilisé, puis prendre deux pinces et maintenez une extrémité de l'oviducte. Avec la pince autre, presser doucement, comme un tube de dentifrice, pour éjecter toute l'embryon.
   
   Note: Ceci créera une grande quantité de désordre dans la boîte de Pétri, comme beaucoup de tissu viendra avec elle, de sorte que vous pouvez utiliser un plat différent de Pétri par la suite.
   
   
3. Pour voir les embryons, l'accent sur les morceaux de gras de microscope et rechercher des rondes "morceau gras" avec cercle clair autour de lui.
   
   Remarque: Les embryons ont le même aspect que la graisse, donc il peut être difficile à trouver. Les embryons couler au fond, alors regardez là-bas.
   
   
4. Ne frottis vaginaux de femelles receveuses. A ce stade, ils devraient être pseudogravides.

Discussion

Dans cet article, nous démontrons la récupération d'ovocytes à partir de l'ovulation induite (superovulation) Peromyscus. L'utilisation de superovulation (par opposition à cycle œstral naturel) est commune en raison du nombre beaucoup plus important qui en résulte. Cependant, il faut être prudent dans l'interprétation des résultats en utilisant des ovocytes de telles / embryons, à la fois comme les hormones utilisées pour induire l'ovulation et la culture peuvent avoir des effets.

Lorsque œstral a été confirmée, et les femelles sont euthenized oviductes récupéré avec une petite portion de l'ovaire. La petite région de l'ovaire est utilisé comme marqueur pour l'emplacement de la infindibulum. Le infindibulum s'assoit à côté de l'ovaire, il arrive souvent saillie à travers une mince couche de tissu. De l'autre côté de ce tissu, le reste de l'oviducte est enroulé et mène éventuellement dans le vagin. Il est préférable de pousser le fluide à travers infindibulum pour extraire les ovocytes. Cette orientation est nécessaire en raison d'une valve à sens unique située à l'interface vagin oviducte. Les ovocytes peuvent être lésés si elles sont projetées vers l'arrière à travers la valve.

Une aiguille de 30 gaugle extrémité émoussée est inséré dans le infindibulum. L'aiguille extrémité émoussée s'adapte à l'ouverture infindibulum, mais n'entre pas dans le tube oviducte. Par conséquent, des précautions doivent être prises pour assurer la infindibulum n'est pas endommagé lors de la dissection ou de ponction ovocytaire. Si le infindibulum est endommagé, le tuyau oviducte peut être serré par une pince pour permettre à tout ovocytes piégés pour sortir.

En supposant que la femelle était en œstrus, les organes reproducteurs aura un aspect rouge en raison de l'approvisionnement en sang ont augmenté et semblent gonflés. Nous avons observé des différences dans les deux espèces de souris sylvestres testées: P. polionotus avait ovaires beaucoup plus gras et oviductes que P. maniculatus, rendant la récupération d'ovocytes plus difficile.

Une fois les ovocytes ont retiré de l'oviducte, elles peuvent être observées en microscopie optique à faible grossissement. Affichage des ovocytes à un faible grossissement permet à l'utilisateur de numériser rapidement la boîte de Pétri. Le microscope doit être axée sur la couche inférieure de granulations graisseuses. Les ovocytes ressemblera parfaitement rond granulations graisseuses avec un anneau clair autour de l'extérieur. Pour vous aider à détecter les ovocytes, essayez d'ajuster la lumière se projetant à travers la boîte de Pétri. En outre, si la boîte de Pétri est légèrement secouée ovocytes ne bouge pas par rapport aux gouttelettes de graisse. Ces conseils peuvent aider le chercheur novice de repérer les ovocytes, mais il est probable que plusieurs essais seront nécessaires avant que l'on est à l'aise avec la procédure.

Les ovocytes isolés peuvent être utilisés dans une variété d'expériences, y compris la production de lignées de cellules souches, la production de chimères, ou les manipulations génétiques. Alors que nous avons trouvé une variation considérable dans les paramètres et le calendrier nécessaire pour induire l'ovulation, les techniques générales pour la récupération devrait être applicable à de nombreuses espèces de rongeurs (souris sylvestres sont ~ 30.000.000 années divergé de souris de laboratoire à la fois et les rats). Nous sommes particulièrement bon espoir que cela profitera à ceux qui travaillent dans les systèmes de roman où de telles techniques ne sont pas bien établies.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Flushing needle	Tool	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G blunt
Forceps (2)	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Peromyscus	Animal	Peromyscus Genetic Stock Center
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
FHM HEPES Buffered Media	Reagent	Specialty Media	MR-025-d
KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL)	Reagent	Specialty Media	MR-020P-5F
Mouth Pipette	Tool			Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing
Oocyte holding dish	Tool			Glass container with concave divets