Recuperación de los ovocitos de ratón

Summary

Este protocolo se muestra la técnica para la extracción de los ovocitos o embriones en estadio temprano fertilizados del oviducto de los ratones. La capacidad de identificar la infindibulum e insertar una aguja de punta roma en que es esencial para la correcta realización del procedimiento.

Abstract

Hasta la fecha, sólo unos pocos estudios han informado de manipulaciones éxito de la embriogénesis Peromyscus o la biología reproductiva. Junto con el archivo Peromyscus Centro Genético (http://stkctr.biol.sc.edu), estamos caracterizando las diferencias relevantes necesarios para desarrollar este sistema. Un objetivo principal ha sido optimizar los ovocitos / recuperación temprana del embrión.

Protocol

Los ovocitos / embriones de recuperación

1. Al menos dos horas antes de la recuperación de ovocitos / embriones, KSOM se coloca en el 37 º C incubadora de CO ₂ y FHM se deben descongelar a partir de -20 º. Un plato de vidrio que contiene tres pozos de poca profundidad cóncava se utiliza a las caídas de la casa de KSOM en la incubadora. Para prevenir la deshidratación, la KSOM y el plato se colocan en un recipiente con tapa que tiene el agua en la parte inferior. Este aparato evita la evaporación sin el uso de aceite mineral.
   
   
2. Los oviductos de una hembra ovula se colocan en los medios de FHM. Para garantizar una orientación y un infindibulum intacta, una pequeña sección del ovario se corta a lo largo de la sección del oviducto y pequeñas del útero. Un contundente 30 aguja se utiliza para expulsar a los ovocitos / embriones del oviducto mediante la inserción de la aguja de punta roma en el infindibulum. El infindibulum debe ser utilizado para recuperar los embriones desde el tubo de oviducto es demasiado pequeño para una aguja de pasar. En el caso de que el infindibulum se destruye, el oviducto debe ser tajo o embriones expulsados.
   
   
3. Ovocitos / embriones se encuentran en los medios de FHM, centrándose en el microscopio las gotas de grasa que se han hundido en la parte inferior de la placa de Petri. Los ovocitos / embriones aislamiento se puede lograr a 20x, ya que proporciona una mayor área de visualización de gran aumento. Embriones / ovocitos parecen ronda gotitas de grasa que tienen un claro anillo a su alrededor. Pipetear con la boca, con un vaso tirado capilar, se utiliza para mover ovocitos / embriones de KSOM para la incubación y su posterior manipulación.

Procedimiento para la recuperación de los ovocitos

Preparación

1. Descongele FHM y preparar KSOM.
2. Unas horas antes, KSOM colocarlo en un recipiente la extracción de óvulos y el lugar en el cuadro de la punta con agua en el fondo, lugar en incubadora de CO _2.
3. Traiga jaulas para el laboratorio y matar a las hembras de la cosecha.
4. Cortar el oviducto, teniendo cuidado de cortar algunos de los ovarios y algunos del útero para asegurarse de que no se cortó parte de oviducto.
5. Lugar en los medios de FHM en pequeña placa de Petri.
6. Vierta un par de placas de Petri FHM los medios de comunicación que se utilizarán para el lavado.

Flushing

1. Use una aguja de lavado (30 calibre romo) conectado a una aguja de 1 ml con final en espiral.
2. Tome un oviducto a la vez y con la aguja, insertar en infundíbulo encuentra cerca de la parte del ovario izquierdo adjunto. Si el infundíbulo se destruye y no se puede utilizar, luego tomar dos pinzas y sostener un extremo del oviducto. Con la pinza de otros, apriete suavemente, como un tubo de pasta de dientes, para expulsar el embrión.
   
   Nota: Esto creará una gran cantidad de desorden en la placa de Petri, ya que una gran cantidad de tejido se vienen con él, por lo que es posible que desee utilizar otra placa de Petri después.
   
   
3. Para ver los embriones, se centran en el microscopio de las piezas de grasa y buscar todo "pedazo de grasa" con el círculo claro que lo rodea.
   
   Nota: Los embriones tienen el mismo aspecto que la grasa, lo que puede ser difícil de encontrar. Los embriones se hunden hasta el fondo, a fin de buscar allí.
   
   
4. Hacer frotis vaginal de las hembras receptoras. En esta etapa, deben ser pseudopreñadas.

Discussion

En este artículo, se demuestra la recuperación de los ovocitos de la ovulación inducida (superovuladas) Peromyscus. El uso de superovulación (en comparación con el ciclo estral natural) es común debido a un número mucho mayor resultado. Sin embargo, se debe tener cuidado al interpretar los resultados de la utilización de ovocitos como / embriones, ya que tanto las hormonas utilizadas para inducir la ovulación y el cultivo puede tener efectos.

Cuando estro ha sido confirmado, las mujeres son euthenized y los oviductos se recuperó con una pequeña porción de ovario. La pequeña región de ovario es utilizado como un marcador para la ubicación de la infindibulum. El infindibulum se sienta al lado del ovario, a menudo se proyecta a través de una capa delgada de tejido. En el otro lado de este tejido, el resto del oviducto es en espiral y, finalmente, desemboca en la vagina. Lo mejor es llevar el líquido a través de la infindibulum para extraer los ovocitos. Esta dirección es necesaria debido a una válvula de una vía ubicada en la interfaz de la vagina, oviducto. Los ovocitos pueden ser perjudicados si se proyecta hacia atrás a través de la válvula.

Una aguja de 30 gaugle extremo romo se inserta en el infindibulum. La aguja de punta roma se ajusta la apertura infindibulum, pero no entra en el tubo oviducto. Por lo tanto, se debe tener cuidado para asegurar la infindibulum no se dañe durante la disección o la recuperación de oocitos. Si el infindibulum está dañado, el tubo de oviducto se puede exprimir a través de una pinza para permitir que los ovocitos atrapados para salir.

Suponiendo que la hembra estaba en celo, los órganos reproductivos tendrá un aspecto rojo debido al mayor suministro de sangre y aparece hinchada. Se observaron diferencias en las dos especies de ciervo ratón probado: P. polionotus tenían ovarios y oviductos mucho más grasa que P. maniculatus, por lo que la recuperación de oocitos más difícil.

Una vez que los ovocitos se han retirado del oviducto, que puede ser observada al microscopio óptico a bajo aumento. Visualización de los ovocitos con un aumento inferior permite al usuario escanear rápidamente la placa de Petri. El microscopio debe centrarse en la capa inferior de los gránulos de grasa. Los ovocitos se verá como gránulos de grasa perfectamente redondo con un anillo blanco alrededor del exterior. Para ayudar en la detección de los ovocitos, intente ajustar la luz se proyecta a través de la placa de Petri. Además, si la placa de Petri es ligeramente sacudido los ovocitos no se moverá en comparación con las gotitas de grasa. Estas sugerencias pueden ayudar al investigador novato para localizar los óvulos, sin embargo, es probable que varios ensayos serán necesarios antes de que uno se siente cómodo con el procedimiento.

Los ovocitos aislados se pueden utilizar en una variedad de experimentos incluyendo la producción de líneas de células madre, la producción de quimeras, o la manipulación genética. A pesar de que han encontrado una considerable variación en los parámetros y el calendario para inducir la ovulación, las técnicas generales para la recuperación debe ser aplicable a muchas especies de roedores (ratones de los ciervos son aproximadamente 30 millones años se separaron de los ratones de laboratorio y las ratas). Estamos particularmente la esperanza de que esto beneficiará a las personas que trabajan en los sistemas de novela en la que tales técnicas no están bien establecidos.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Flushing needle	Tool	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G blunt
Forceps (2)	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Peromyscus	Animal	Peromyscus Genetic Stock Center
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
FHM HEPES Buffered Media	Reagent	Specialty Media	MR-025-d
KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL)	Reagent	Specialty Media	MR-020P-5F
Mouth Pipette	Tool			Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing
Oocyte holding dish	Tool			Glass container with concave divets