Recupero degli ovociti mouse

Summary

Questo protocollo illustra la tecnica per l'estrazione di ovociti o di embrioni fecondati in fase iniziale dalla ovidotto di topi. La capacità di identificare i infindibulum e inserire un ago senza punta fine in esso è essenziale per eseguire correttamente la procedura.

Abstract

Fino ad oggi, solo pochi studi hanno riportato manipolazioni successo dell'embriogenesi Peromyscus o biologia riproduttiva. Insieme con la Borsa di Centro Genetico Peromyscus (http://stkctr.biol.sc.edu), si stanno caratterizzando le differenze salienti necessari per sviluppare questo sistema. Un obiettivo primario è stato quello di ottimizzare ovociti / recupero embrione precoce.

Protocol

Embrione / recupero degli ovociti

1. Almeno due ore prima il recupero degli embrioni / ovociti, KSOM si trova nel 37 º C CO ₂ incubatore e FHM devono essere scongelati da -20 °. Un piatto di vetro contenente tre pozzi poco profondi concava viene usato per gocce casa di KSOM nell'incubatrice. Per prevenire la disidratazione, la KSOM piatto e sono posti in un contenitore con coperchio che ha l'acqua sul fondo. Questo apparecchio evita l'evaporazione senza l'uso di olio minerale.
   
   
2. Gli ovidotti da una femmina l'ovulazione sono posti nei media FHM. Per garantire l'orientamento e un infindibulum intatto, una piccola sezione delle ovaie viene tagliato con la sezione ovidotto e piccoli dell'utero. Un brusco 30 gauge viene utilizzato per espellere gli embrioni / ovociti dalla ovidotto inserendo l'ago smussato nel infindibulum. Il infindibulum deve essere utilizzato per recuperare gli embrioni in quanto il tubo ovidotto è troppo piccolo per un ago per passare. Nel caso in cui il infindibulum è distrutto, l'ovidotto deve essere affettato aperto o embrioni spremuto.
   
   
3. Gli embrioni / ovociti si trovano nei media FHM puntando al microscopio sulla goccioline di grasso che hanno toccato il fondo della scatola di Petri. Embrione / ovocita isolamento può essere ottenuto a 20x come questa fornisce un'area di visualizzazione più grande di ingrandimento. Embrione / ovociti sembrano rotonda goccioline di grasso che hanno un anello chiaro intorno ad esso. Pipette a bocca, utilizzando un bicchiere tirato capillare, viene utilizzato per spostare gli embrioni / ovociti per KSOM per l'incubazione e di ulteriori manipolazioni.

Procedura per il recupero degli ovociti

Preparazione

1. Scongelare FHM e preparare kSOM.
2. Poche ore prima, kSOM porlo in un contenitore prelievo degli ovociti e il luogo in scatola punta con acqua sul fondo, luogo di CO ₂ incubatore.
3. Portare gabbie al laboratorio e uccidere le femmine raccolta.
4. Ritagliate le ovidotto facendo attenzione a tagliare alcune delle ovaie e dell'utero alcuni per assicurarsi di non tagliare fuori parte della ovidotto.
5. Posto nei media FHM in piccole piastre di Petri.
6. Versare un paio di mezzi di comunicazione più FHM piastre di Petri da utilizzare per il lavaggio.

Flushing

1. Utilizzare un ago di lavaggio (30 gauge blunt) collegato ad un ago 1 ml con terminale a spirale.
2. Prendete un ovidotto alla volta e con l'ago, inserire infundibolo trova vicino alla parte dell'ovaio sinistro collegato. Se l'infundibolo è distrutto e non può essere usato, poi prendere due pinze e tenere un capo del ovidotto. Con la pinza altri, premere delicatamente, come un tubetto di dentifricio, per espellere ogni dell'embrione.
   
   Nota: Questo creerà una grande quantità di disordine nella scatola di Petri, come un sacco di tessuto verranno con esso, quindi si consiglia di utilizzare un piatto diverso Petri dopo.
   
   
3. Per vedere gli embrioni, messa a fuoco microscopio su pezzi di grasso e cercare rotonda "pezzo di grasso", con chiaro cerchio intorno ad esso.
   
   Nota: Gli embrioni hanno lo stesso aspetto come il grasso, quindi potrebbe essere difficile da trovare. Gli embrioni si depositano sul fondo, in modo da guardare là.
   
   
4. Fare strisci vaginali delle donne destinatario. In questa fase, dovrebbero essere pseudopregnant.

Discussion

In questo articolo, dimostriamo il recupero di ovociti da ovulazione indotta (superovulated) Peromyscus. L'uso di superovulazione (al contrario di naturale ciclo estrale) è comune a causa del numero molto maggiore che ne derivano. Tuttavia, bisogna fare attenzione nell'interpretare tali risultati utilizzando ovociti / embrioni, in quanto entrambi gli ormoni usati per indurre l'ovulazione e la coltura può avere effetti.

Quando estrale è stata confermata, le femmine sono euthenized e ovidotti recuperato insieme ad una piccola porzione di ovaio. La piccola regione di ovaio viene utilizzato come marker per la posizione del infindibulum. Il infindibulum siede accanto a dell'ovaio, spesso proiettando attraverso un sottile strato di tessuto. Dall'altra parte di questo tessuto, il resto del ovidotto è avvolto a spirale e conduce infine nella vagina. E 'meglio per spingere il fluido attraverso infindibulum per estrarre gli ovociti. Questa direzione è necessario a causa di una valvola in un modo trova la vagina-ovidotto interfaccia. Gli ovociti possono essere danneggiati se vengono proiettati all'indietro attraverso la valvola.

A 30-gaugle ago senza punta viene inserita nel infindibulum. L'ago punta smussata si inserisce l'apertura infindibulum, ma non adatta alla tubazione ovidotto. Pertanto, la cura deve essere adottate per garantire l'infindibulum non sia danneggiato durante la dissezione o il recupero degli ovociti. Se il infindibulum è danneggiato, il tubo ovidotto può essere spremuto via pinze per permettere a tutti gli ovociti intrappolati per uscire.

Supponendo che la femmina era in estro, gli organi riproduttivi avrà un aspetto rosso a causa di maggior afflusso di sangue e appaiono gonfie. Abbiamo osservato delle differenze nelle specie cervo mouse a due testate: P. polionotus era molto più grassa ovaie e tube di P. maniculatus, rendendo più difficile il recupero degli ovociti.

Una volta che gli ovociti hanno rimosso dal ovidotto, possono essere osservati al microscopio ottico a basso ingrandimento. Guarda gli ovociti con un ingrandimento inferiore permette all'utente di eseguire la scansione della piastra di Petri in fretta. Il microscopio dovrebbe essere incentrata sulla strato inferiore di granuli di grasso. Gli ovociti sarà simile a granuli di grasso perfettamente rotonda, con un anello chiaro intorno alla parte esterna. Per aiutare a individuare gli ovociti, provare a regolare la luce proiettando attraverso la piastra di Petri. Inoltre, se la piastra di Petri è leggermente scosso ovociti non si muove rispetto al goccioline di grasso. Questi suggerimenti possono aiutare il ricercatore alle prime armi per individuare gli ovociti, ma è probabile che diverse prove saranno necessari prima che uno sta bene con la procedura.

Gli ovociti isolati può essere utilizzato in una varietà di esperimenti compresa la produzione di linee di cellule staminali, la produzione di chimere, o manipolazioni genetiche. Anche se abbiamo trovato notevoli differenze nei parametri ei tempi necessari per indurre l'ovulazione, le tecniche generali per il recupero dovrebbe essere applicabile a molte specie di roditori (topi cervi sono ~ 30 milioni anni si è discostato da entrambi topi e ratti da laboratorio). Siamo particolarmente fiduciosi che questo andrà a beneficio coloro che lavorano negli impianti romanzo in cui tali tecniche non sono ben definiti.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Flushing needle	Tool	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G blunt
Forceps (2)	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Peromyscus	Animal	Peromyscus Genetic Stock Center
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
FHM HEPES Buffered Media	Reagent	Specialty Media	MR-025-d
KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL)	Reagent	Specialty Media	MR-020P-5F
Mouth Pipette	Tool			Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing
Oocyte holding dish	Tool			Glass container with concave divets