Retrieval von Maus-Oozyten

Summary

Dieses Protokoll zeigt die Technik zur Gewinnung von Eizellen oder Early-Stage-befruchteten Embryonen aus dem Eileiter von Mäusen. Die Fähigkeit, die infindibulum identifizieren und legen Sie eine stumpfe Ende Nadel in ist es wichtig, richtig Durchführung des Verfahrens.

Abstract

Bis heute haben nur wenige Studien, erfolgreiche Manipulationen Peromyscus Embryogenese oder Reproduktionsbiologie berichtet. Zusammen mit dem Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), sind wir die Charakterisierung der markanten Unterschiede notwendig, um dieses System zu entwickeln. Ein primäres Ziel war es, Eizellen / frühen Embryo Abruf zu optimieren.

Protocol

Embryo / Eizellen

1. Mindestens zwei Stunden vor dem Abruf von Embryonen / Eizellen, KSOM ist in der 37 º C CO _2-Inkubator und FHM platziert werden müssen von -20 ° aufgetaut werden. Eine Glasschale mit drei konkave seichten Brunnen ist zu Haus Tropfen KSOM im Inkubator verwendet. Um zu verhindern, Dehydrierung, sind die KSOM und Geschirrtücher in einen Behälter mit Deckel, dass Wasser an der Unterseite angebracht. Dieses Gerät verhindert die Verdunstung ohne den Einsatz von Mineralöl.
   
   
2. Die Eileiter von einem Eisprung weiblich sind in FHM Medien platziert. Um sicherzustellen, Orientierung und eine intakte infindibulum, ist ein kleiner Abschnitt des Eierstocks zusammen mit den Eileiter und kleinen Abschnitt der Gebärmutter geschnitten. Ein stumpfes 30-Gauge-Nadel wird benutzt, um Embryonen / Eizellen aus dem Eileiter, indem Sie die stumpfe Nadel in die infindibulum vertreiben. Die infindibulum muss verwendet werden, um die Embryonen abgerufen werden, da die Eileiter Schlauch ist zu klein für eine Nadel passieren. Für den Fall, dass die infindibulum zerstört wird, muss der Eileiter entweder in Scheiben geschnitten werden offen oder Embryonen herausgedrückt.
   
   
3. Embryonen / Eizellen werden in der FHM Medien durch die Fokussierung des Mikroskops auf den Fett-Tröpfchen, die auf den Boden der Petrischale versenkt gefunden haben. Embryo / Eizelle Isolation kann bei 20x erreicht werden, da dies einen größeren Bildbereich als starker Vergrößerung. Embryo / Eizellen aussehen wie runde Fetttröpfchen, dass eine klare Ring um ihn herum zu haben. Pipettieren mit dem Mund, mit einem gezogenen Glaskapillare, wird verwendet, um Embryonen / Eizellen zu KSOM für die Inkubation und weitere Manipulationen zu bewegen.

Verfahren für die Eizellentnahme

Vorbereitung

1. Thaw FHM und bereiten kSOM.
2. Ein paar Stunden früher, Ort kSOM in Eizellenabnahme Container und in tip-Box mit Wasser in den Boden, in CO _2-Inkubator.
3. Bringen Käfigen ins Labor und tötet die Ernte Frauen.
4. Schneiden Sie den Eileiter darauf achten, einige der Eierstock und einige der Gebärmutter geschnitten, um sicherzustellen, dass Sie nicht abgeschnitten Teil der Eileiter.
5. Legen Sie in FHM Medien in kleinen Petrischale.
6. Gießen Sie ein paar mehr FHM Medien Petrischalen bis zum Spülen verwendet werden.

Flushing

1. Verwenden Sie eine Spülung Nadel (30 Gauge stumpf) verbunden mit einem 1ml Nadel mit Spirale zu beenden.
2. Nehmen Sie eine Eileiter zu einem Zeitpunkt und mit Nadel, insert into Infundibulum in der Nähe der Teil des Eierstocks linken befestigt gefunden. Wenn das Infundibulum wird zerstört und kann nicht verwendet werden, dann nehmen Sie zwei Pinzetten und halten Sie das eine Ende der Eileiter. Mit der anderen ForceP, drücken Sie leicht, wie eine Zahnpastatube, jede Embryos auszuwerfen.
   
   Hinweis: Damit wird eine große Menge von Unordnung in der Petrischale zu erstellen, wie viel Gewebe mit ihm kommen, so möchten Sie vielleicht eine andere Petrischale später verwenden.
   
   
3. Um Embryonen zu sehen, konzentrieren Mikroskop auf Fettstücke und suchen Sie nach rund "fettes Stück" mit klaren Kreis um ihn herum.
   
   Hinweis: Die Embryonen haben das gleiche Aussehen wie das Fett, so kann es schwer zu finden. Die Embryonen zu Boden sinken, so dass es zu suchen.
   
   
4. Sie Vaginalabstriche des Empfängers Frauen. In dieser Phase sollten sie pseudoschwangeren.

Discussion

In diesem Artikel zeigen wir, das Abrufen von Oozyten aus dem Eisprung-induzierte (superovulierten) Peromyscus. Die Verwendung von Superovulation (im Gegensatz zu natürlichen Zyklusstand Gegensatz) ist üblich aufgrund der viel größeren resultierenden Zahlen. Allerdings ist Vorsicht geboten bei der Interpretation von Ergebnissen Verwendung solcher Eizellen / Embryonen, da sowohl die Hormone verwendet, um den Eisprung und Kultivierung induziert Auswirkungen haben können, berücksichtigt werden.

Wenn estrous bestätigt wurde, sind Frauen euthenized und Eileitern sowie ein kleiner Teil des Eierstocks erholt. Die kleine Region des Ovars wird als Marker für die Position des infindibulum verwendet. Die infindibulum sitzt neben dem Eierstock, oft auch durch eine dünne Gewebeschicht projizieren. Auf der anderen Seite dieses Gewebes ist der Rest der Eileiter gewickelt und führt schließlich in die Vagina. Es ist am besten, um Fluid durch die infindibulum Push-to-die Eizellen zu extrahieren. Diese Richtung ist notwendig, da ein Rückschlagventil in die Vagina-Eileiter-Schnittstelle entfernt. Die Eizellen können geschädigt werden, wenn sie rückwärts durch das Ventil projiziert werden.

Ein 30-gaugle stumpfen Ende Nadel in die infindibulum eingefügt. Das stumpfe Ende Nadel passen die infindibulum Öffnung, wird aber nicht in den Eileiter Schläuche passen. Deshalb muss darauf geachtet werden, die infindibulum nicht beim Präparieren oder Follikelpunktion beschädigt werden. Wenn die infindibulum beschädigt ist, kann der Eileiter Schlauch über Zange gequetscht werden, damit eventuell eingeschlossene Eizellen zu beenden.

Vorausgesetzt, die Frau wurde in Östrus wird die Fortpflanzungsorgane haben ein rotes Aussehen durch erhöhte Blutzufuhr und geschwollen aus. Wir beobachteten Unterschiede in den beiden Hirsche Maus untersuchten Arten: P. polionotus hatte viel fetthaltiger Eierstöcke und Eileiter als P. maniculatus, was Follikelpunktion erschwert.

Sobald die Eizellen aus dem Eileiter entfernt haben, können sie unter dem Lichtmikroskop bei geringer Vergrößerung beobachtet werden. Anzeigen der Eizellen bei geringer Vergrößerung ermöglicht dem Benutzer, der Petrischale schnell scannen. Das Mikroskop sollte auf der untersten Schicht von Fettkörnchen fokussiert werden. Die Eizellen werden wie perfekt runde Fettkörnchen mit einem klaren Ring um die Außenseite zu suchen. Um bei der Erfassung der Eizellen Hilfe, versuchen Sie, das Licht projizieren durch die Petrischale. Darüber hinaus wird, wenn der Petrischale wird leicht geschüttelt Eizellen nicht auf die Fett-Tröpfchen im Vergleich zu bewegen. Diese Hinweise können helfen, den Neuling Forscher die Eizellen zu finden, jedoch ist es wahrscheinlich, dass mehrere Versuche notwendig sein wird, bevor man bequem mit dem Verfahren ist.

Die isolierte Eizellen können in einer Vielzahl von Experimenten einschließlich der Erzeugung von Stammzelllinien, die Produktion von Chimären oder genetische Manipulationen verwendet werden. Während wir erhebliche Unterschiede in den Parametern und zeitlichen Vorgaben zur Einleitung des Eisprungs gefunden haben, sollte die allgemeine Techniken für den Abruf werden auf viele Nagetieren (Mäuse sind Hirsche ~ 30.000.000 Jahre von Labor-Mäusen und Ratten auseinander). Wir sind besonders vielversprechend, dass dies die Beschäftigten in neue Systeme, in denen solche Techniken nicht gut etablierte profitieren.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Flushing needle	Tool	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G blunt
Forceps (2)	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Peromyscus	Animal	Peromyscus Genetic Stock Center
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
FHM HEPES Buffered Media	Reagent	Specialty Media	MR-025-d
KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL)	Reagent	Specialty Media	MR-020P-5F
Mouth Pipette	Tool			Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing
Oocyte holding dish	Tool			Glass container with concave divets