Summary
Electroolfactogram (EOG) запись информативный, простой в поведении, и надежный способ оценки обонятельной функции на уровне обонятельного эпителия. Этот протокол описывает настройки записи, подготовка ткани мыши, сбор данных, и основной анализ данных.
Abstract
Животные зависит от обоняния для многих критических поведения, такие как поиск источников пищи, избегая хищников, а также выявление conspecifics для спаривания и других социальных взаимодействий. Electroolfactogram (EOG) запись информативными, легко провести, и надежный метод анализа обонятельной функции на уровне обонятельного эпителия. С 1956 описание ЭОГ по Оттосон в лягушек 1, EOG записи уже применяются во многих позвоночных, в том числе саламандры, кроликов, крыс, мышей и человека (рассматривается Скотт и Scott-Джонсона, 2002 г., исх. 2). Последних достижений в области генетических модификаций у мышей, возродили интерес к записи ЭОГ для физиологических характеристик обонятельной функции в нокаут и стук-у мышей. EOG записи были успешно применены для демонстрации центральную роль обонятельных передачи сигнала компонентов 3-8, а в последнее время для характеристики вклада определенных регулирующих механизмов для OSN ответы 9-12.
Одоранта обнаружения происходит на поверхности обонятельного эпителия на реснички OSNs, где каскад передачи сигнала приводит к открытию ионных каналов, создавая ток, который течет в ресничек и деполяризации мембраны 13. EOG является отрицательный потенциал записан внеклеточно на поверхности обонятельного эпителия при одоранта стимуляции, в результате суммирования потенциальные изменения, вызванные отдельными реагировать OSNs в поле записи 2. Сравнение амплитуды и кинетики EOG таким образом получить ценную информацию о том, как генетическая модификация и другие экспериментальные манипуляции влияние молекулярной сигнализации, лежащие в основе ОСН ответ на запах.
Здесь мы опишем воздушной фазы EOG записи на подготовку мыши обонятельных раковин. Короче говоря, после того ущерба для мыши, обонятельных раковин которые предоставляются рассекает голову по средней линии и удаления перегородки. Подготовка раковин помещается в настройки записи, и запись электрод помещается на поверхности обонятельного эпителия на одном из медиальной раковин. Электрод электрически соединен с ткани через буферный раствор. Непрерывный поток увлажненный воздух подается на поверхность эпителия держать его влажным. Паров одоранта решений пыхтел в поток увлажненного воздуха, чтобы стимулировать эпителия. Ответы записываются и оцифрованы для дальнейшего анализа.
Protocol
Часть 1. EOG настройки записи
Регистрирующей аппаратуры состоит из записи электрод, электрод сравнения, трубки подачи воздуха, образец этапе и рассекает микроскоп, все зиждется на воздухе таблице в клетку Фарадея. Микроманипуляторы используются для размещения электродов и трубки подачи воздуха. Непрерывный поток воздуха пропускают через дистиллированную воду, чтобы добавить влажности до прохождения через трубку подачи воздуха и более образцов. 60 мм культуры блюдо заполнено Sylgard на глубину 6-8 мм используется в качестве монтажной поверхности для образца. Ну и канал выдолбленные из Sylgard в монтажной блюдо, чтобы обеспечить средства для электрического соединения электрода к образцу через решение изменение Рингера.
Электрод записи и электрода сравнения подключены к усилителю. Сигналы от усилителя направляются дигитайзер, а затем компьютер. Программное обеспечение таких как Axograph или pClamp могут быть использованы для контроля стимуляции протокола, для записи сигнала, так и для последующего анализа ответов. Осциллограф подключен после усилитель может быть удобно для мониторинга в реальном времени электрического потенциала при размещении записи электрода и в течение EOG записей.
Доставка одоранта стимулы контролируется Picospritzer, который подключен к той же компьютер используется для получения сигнала. Давление воздуха на Picospritzer составляет 10 фунтов на квадратный дюйм. На одном баке воздуха и регулятор может быть использован для подачи воздуха для обеих таблиц воздуха и Picospritzer. Второй танк воздуха и регулятор используется для подачи воздуха для увлажненных воздушного потока, так как это требует более низкого давления и большой объем воздуха. Незадолго до доставки одоранта стимул, выход Picospritzer подключен к одоранта бутылку. Одоранта бутылку затем подключается к трубе подачи воздуха.
Часть 2: Подготовка электродов
Запись электрод chlorided серебряной проволоки в вытащил стеклянный капилляр заполненный раствором изменение Рингера (135 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ CaCl 2, 1,5 мМ MgCl 2, 10 мМ HEPES, рН 7,4, фильтруют стерилизованные). Электрода сравнения chlorided серебряной проволоки.
- Установить серебряной проволоки в держатель электрода. Для записи электрода, один для двух сантиметров провода должны выступать с конца держателя электрода. Более провод можно оставить для электрода сравнения.
- Чтобы добавить AgCl пальто серебряной проволокой, положение проволоки в 0,1 М NaCl и подключить держатель электрода к положительному выводу 1.5-9 V источник питания постоянного тока. Отрицательный вывод источника питания должен быть электрически соединен с 0,1 М раствора NaCl. Разрешить chloriding протекания реакции в течение 10 минут. Для выравнивания статического заряда между записью и электрода сравнения, кратко коснуться электродов вместе перед их установкой на регистрирующей аппаратуры.
- Вытяните стеклянный капилляр использованием съемника микропипетки. Открытие на кончике капилляра должна быть около 5-10 мкм в диаметре.
- Используйте алмазный карандаш, чтобы оценка и разорвать тупым концом капилляра, так что ~ 2 см длиннее серебряной проволоки. Пожар-польский срез с бутан факел.
- Растопите 0,5% агарозы в растворе изменение Рингера. Вытяните небольшое количество раствора в расплаве агарозы в кончик электрода использованием передачи пипетки.
- Заполните вытащил капиллярной около 1 / 2 пути с решением изменение Рингера (шприц, которая была разогрета и вытащил иметь длинный тонкий конец полезно для этой цели). Аккуратно вылить содержимое капиллярных выбить любые воздушные пузыри. Магазин заполнен электрода в хранилище банка с небольшим количеством раствора Рингера изменение в нижнем пока они не готовы к использованию. Как только образец ткани подготовлены и готовы к записи, установить заполнить капиллярные за проволочным электродом записи.
Часть 3: Подготовка решений одоранта
Ацетат отдушки амиловый и heptaldehyde вызывают большие ответы и, таким образом, хороший выбор как EOG стимуляторов.
- В микроцентрифужных труб, подготовить серию разведений одоранта в диметилсульфоксид (ДМСО). В качестве отправной точки для кривой доза-реакция, готовят 10-кратные разведения от 5 м до 5 х 10 -6 М. Сделайте свежие разведения каждый день.
- Дальнейшее разбавление отдушки 50-кратного в воду путем смешивания 100 мкл разбавленного акции в ДМСО с 4,9 мл воды в 2 бутылки унцию с силиконовыми пробками. Пусть решения равновесие в бутылках не менее 30 минут. Обратите внимание, что концентрация паров одорантов в каждой бутылке, неизвестно, но будет варьироваться в зависимости от концентрации пахучих веществ в жидкой фазе.
- Вставьте две 18-иглы через кремний пробкой рrovide входных и выходных портов. Порты должны быть подключены, если бутылка не используется.
Часть 4: Запись EOG и анализа данных
- Жертва мыши СО 2 эвтаназии или передозировка анестетика следует обезглавливание. Удаление кожного покрова черепа и sagittally пополам голову по средней линии.
- Горы половину головы, медиальной стороной вверх, на монтажной блюдо. Осторожно удалите перегородки подвергать раковин.
- Место блюдо с установленными ткани на стадии записи. Совместите этапе, с тем, что записи на месте раковин по центру под микроскопом.
- Включите баллон с воздухом для доставки увлажненного воздуха на поверхность раковин. Установите трубку подачи воздуха так, чтобы она составляет примерно 10 мм от записи местоположения. Расход ~ 600 мл / мин.
- Установите усилитель в постоянный режим (AC усиление будет вызывать артефакты в EOG сигнала) с ФНЧ на частоте 1 кГц, и получить на 100X.
- Горы записи и электродов на микроманипуляторами.
- Нижний электрод в скважину на монтаж блюдо и накрыть решение изменение Рингера такова, что она имеет электрическое соединение с тканью.
- Осторожно опустите записи электродов на поверхность раковин IIb или III. Электрод должен едва касаться поверхности обонятельного эпителия! Когда электрод приходит в соприкосновение с эпителием (то есть завершает электрической цепи) прямая исходная линия появится в осциллограф.
- Прикрепить одоранта бутылку в сторону порта на трубе подачи воздуха.
- На компьютере, инициировать возбуждение протокола. Частота дискретизации для получения данных должна быть 2 кГц и выше. Программное обеспечение будет вызвать запах пульс и начать запись.
- Типичный протокол стимуляции может быть на 100 мсек одного импульса, в паре 100-мс импульсов, разделенных 1-сек интервал, или 10 сек устойчивый импульс.
- Разрешить какое-то время между протоколами так ткани минимально адаптировать. Одна минута достаточно для жидких концентрации амилацетат и heptaldehyde до 10 -3 М; при более высоких концентрациях позволяют за 5 минут. После доставки высокие концентрации запаха (например, в конце кривой доза-реакция), остаточный запах может остаться в трубе. Вымойте воздушной трубки с 95% этанола и сухой, прежде чем продолжить дополнительные образцы ткани.
- Axograph программное обеспечение предоставляет инструменты для измерения основных параметров EOG сигнала. Такие параметры включают в себя АЧХ, задержка, время до пика, и постоянные времени прекращения. Может быть желательно для цифровой фильтр следов при 25 Гц до дальнейшего анализа.
Представитель Результаты
Рисунок 1. Параметры для EOG анализа. Несколько параметров EOG особенно полезны для сравнения ответов между мышами, в том числе ответ амплитуды, латентности (времени между моментом, когда стимул находится в ведении и реакция начинается), время нарастания (время между началом ответных мер и пик), время до пика (время от начала стимуляции до пика ответа), а постоянная времени прекращения (τ, определяется путем подбора фазе спада ответ на одно показательное уравнение ). Для сравнения кинетических параметров, таких как задержки, время нарастания, и постоянная времени окончания, рекомендуется для нормализации амплитудой ответы до анализа.
Рисунок 2. Представитель EOG сигналы по различным протоколам стимуляции. () Примеры EOGs от мыши в ответ на стимуляцию с увеличением концентрации амилацетат. Черная линия в верхней части панели указывает сроки и продолжительность одоранта стимуляции. Концентрации в легенды концентрации жидкого раствора. (Б) доза-реакция в среднем от пяти мышей. Планки погрешностей на 95% доверительными интервалами. Снижение максимальной амплитудой часто наблюдается при очень высоких концентрациях запах. (С) пример EOG в ответ на парных импульсов стимуляции. Одного короткого импульса одоранта вызывает адаптации длится несколько секунд. (Г) пример EOG в ответ на 10-секундный устойчивого одоранта стимуляции. EOG показывает десенсибилизации при непрерывной презентации одоранта.
Discussion
При установке, описанной в этом протоколе одоранта стимулов на поверхности обонятельного эпителия будет соответствовать между тканевых препаратов, что позволяет для сравнения между дикого типа и мутантных мышей, хотя точная концентрация одоранта и динамика неизвестны. Ряд факторов, в частности о месте записи и скорость потока увлажненного воздуха, вызывают изменения в EOG. Следует проявлять осторожность, чтобы запись из схожие позиции по той же раковины, чтобы минимизировать вариации. Это может быть легко достигнуто последовательно записи с той же стороны головы и поддержания след микроскоп, трубки запах доставки и микроманипуляторами в эфире таблице неизменными между образцы тканей. Кроме того, образцы ткани должны быть немедленно помещены в увлажненные поток воздуха после вскрытия, чтобы предотвратить чрезмерное высыхание ткани.
EOG записи на мышах также может осуществляться с жидким аппарата перфузии на подготовленные мыши раковин 7, 14, 15, или, оставив нетронутыми голову и вставки электрода в маленькое отверстие пробурено выше раковин 16, 17. Каждое изменение EOG записи имеет свои сильные стороны: воздушно-фазы записи на тканевые препараты, как описано в данном протоколе, требуют минимального количества настройки и являются самыми легкими поведения; записи на основе жидкого аппарата перфузии облегчить использование фармакологических реагентов, хотя гидрофобный характер многих отдушки усложняет запах поставки; наконец, записи, в которых голова остается без изменений могут быть использованы в «искусственной нюхать" эксперименты, хотя электрода размещения является более трудным, чем когда раковин являются полностью открыты.
Disclosures
Мыши были обработаны и эвтаназии с методами, утвержденными уходу и использованию животных комитетов Университете Джона Хопкинса.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Yijun песни, и члены Хаттар Kuruvilla Чжао три-лаборатории кафедры биологии, Университет Джона Хопкинса за советом и помощью. Поддержке грантов NIH DC007395 и DC009946.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air delivery tube | equipment | Custom Made | The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute | |
| Air table | equipment | Newport Corp. | LW3030B-OPT | |
| Amplifier | equipment | Warner Instruments | DP-301 | |
| Computer and Data Acquisition Software | equipment | Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh | Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/. | |
| Butane torch | equipment | A crème brûlèe torch works well | ||
| Digitizer | equipment | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Dissecting Scope | equipment | Scienscope | SSZ | |
| Electrode holder | equipment | Harvard Apparatus | 64-1021 | |
| Magnetic Holding Devices (12 mm) | equipment | World Precision Instruments, Inc. | M10 | |
| Micromanipulators | equipment | World Precision Instruments, Inc. | M3301R M3301L | |
| Micropipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P2000 | |
| Oscilloscope | equipment | Tektronix, Inc. | 5110 | |
| Picospritzer III | equipment | Parker Hannifin Corporation | ||
| Silicone tubing | equipment | Nalge Nunc international | ||
| Specimen stage | equipment | Custom Made | Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay. | |
| 18 gage needles | material | BD Biosciences | 305195 | |
| 2 oz. glass bottles | material | VWR international | 16152-201 | |
| Glass capillaries | material | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-6 | |
| Silicone stoppers size 16D | material | Chemware | D1069809 | |
| Silver wire | material | World Precision Instruments, Inc. | AGW1010 | |
| SylGuard 184 | material | Dow Corning | SYLG184 | From World Precision Instruments |
| Agarose | reagent | Invitrogen | 15510-027 | |
| Amyl acetate | reagent | Aldrich | W504009 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | reagent | Sigma-Aldrich | C-1016 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | reagent | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| HEPES | reagent | Fisher Scientific | BP310 | |
| Heptaldehyde | reagent | Aldrich | H2120 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O) | reagent | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Sodium chloride (NaCl) | reagent | JT Baker | 3624-05 | |
| flowmeter | equipment | Gilmont Instruments | GF-2260 |
References
- Ottoson, D. Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium. Acta Physiologica Scandinavica. 35, Suppl 122. 1-83 (1956).
- Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. The electroolfactogram: a review of its history and uses. Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20, 69-81 (1998).
- Zhao, H. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279, 237-242 (1998).
- Wong, S. T. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27, 487-497 (2000).
- Munger, S. D. Central role of the CNGA4 channel subunit in Ca2+-calmodulin-dependent odor adaptation. Science. 294, 2172-2175 (2001).
- Michalakis, S. Loss of CNGB1 protein leads to olfactory dysfunction and subciliary cyclic nucleotide-gated channel trapping. J Biol Chem. 281, 35156-35166 (2006).
- Buiakova, O. I. Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9858-9863 (1996).
- Nickell, W. T., Kleene, N. K., Gesteland, R. C., Kleene, S. J. Neuronal chloride accumulation in olfactory epithelium of mice lacking NKCC1. J Neurophysiol. 95, 2003-2006 (2006).
- Song, Y. Olfactory CNG channel desensitization by Ca2+/CaM via the B1b subunit affects response termination but not sensitivity to recurring stimulation. Neuron. 58, 374-386 (2008).
- Cygnar, K. D., Zhao, H. Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons. Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem Senses. 33, 839-859 (2008).
- Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors". J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).
- Pinato, G. Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice. Chem Senses. 33, 397-404 (2008).
- Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W. Regional distribution of rat electroolfactogram. J Neurophysiol. 73, 2207-2220 (1995).
- Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. Effects of air flow on rat electroolfactogram. Chem Senses. 25, 761-768 (2000).
