Summary
electroolfactogram रिकॉर्डिंग (सभी छवियाँ) एक जानकारीपूर्ण, घ्राण उपकला के स्तर पर घ्राण समारोह का आकलन करने के आचरण करने के लिए आसान और विश्वसनीय तरीका है. यह एक रिकॉर्डिंग सेटअप, माउस ऊतक तैयारी, डेटा संग्रह, और बुनियादी डेटा विश्लेषण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.
Protocol
भाग 1. सभी छवियाँ रिकॉर्डिंग सेटअप
रिकॉर्डिंग तंत्र एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड, संदर्भ इलेक्ट्रोड, एयर वितरण ट्यूब, नमूना चरण, और विदारक माइक्रोस्कोप, सभी एक फैराडे पिंजरे के भीतर एक हवा मेज पर लंगर डाले के होते हैं. Micromanipulators इलेक्ट्रोड के स्थान और हवा डिलीवरी ट्यूब के लिए उपयोग किया जाता है. आसुत जल के माध्यम से एक सतत हवा स्ट्रीम bubbled है हवा वितरण ट्यूब के माध्यम से और नमूना से अधिक पारित करने से पहले नमी जोड़ने. एक 60 मिमी संस्कृति Sylgard के साथ 6-8 मिमी की गहराई तक भरा पकवान नमूना के लिए एक बढ़ते सतह के रूप में प्रयोग किया जाता है. एक अच्छी तरह से और एक चैनल के लिए एक साधन प्रदान करने के लिए विद्युत संशोधित घंटी समाधान के माध्यम से नमूना करने के लिए संदर्भ इलेक्ट्रोड कनेक्ट बढ़ते डिश में Sylgard के hollowed हैं.
रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और संदर्भ इलेक्ट्रोड एक एम्पलीफायर से जुड़ा हैं. सिग्नल एम्पलीफायर से एक digitizer के लिए भेजा जाता है और फिर एक कंप्यूटर करने के लिए. Axograph या pClamp जैसे सॉफ्टवेयर उत्तेजना प्रोटोकॉल नियंत्रण, संकेत रिकॉर्ड, और प्रतिक्रियाओं के बाद के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक एम्पलीफायर के बाद जुड़ा आस्टसीलस्कप जबकि रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड रखने विद्युत क्षमता की वास्तविक समय की निगरानी के लिए और सभी छवियाँ रिकॉर्डिंग के दौरान सुविधाजनक हो सकता है.
Odorant उत्तेजनाओं की डिलिवरी एक Picospritzer, जो एक ही संकेत अधिग्रहण के लिए प्रयोग किया जाता कंप्यूटर से जुड़ा है के द्वारा नियंत्रित है. Picospritzer पर हवा का दबाव 10 साई के लिए सेट कर दिया जाता है. एक एकल हवा टैंक और नियामक दोनों हवा की मेज और Picospritzer करने के लिए हवा की आपूर्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक दूसरे हवा टैंक और नियामक humidified हवा प्रवाह के लिए हवा प्रदान करते हैं, के रूप में यह एक कम दबाव और airflow की एक बड़ी राशि की आवश्यकता है प्रयोग किया जाता है. बस पहले एक odorant प्रोत्साहन देने के लिए, Picospritzer उत्पादन का एक odorant बोतल के लिए जुड़ा हुआ है. odorant बोतल तो हवा डिलीवरी ट्यूब से जुड़ा है.
भाग 2: तैयारी इलेक्ट्रोड
रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड एक खींच गिलास केशिका संशोधित घंटी है समाधान (135 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 1 मिमी 2 CaCl, 1.5 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी HEPES, 7.4 पीएच, फिल्टर निष्फल) के साथ भर में एक chlorided चांदी के तार है . संदर्भ इलेक्ट्रोड एक chlorided चांदी के तार है.
- इलेक्ट्रोड धारक में चांदी के तार से स्थापित करें. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए, तार के एक से दो सेंटीमीटर इलेक्ट्रोड धारक के अंत से बहर चाहिए. और तार संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए छोड़ा जा सकता है है.
- चांदी के तार AgCl कोट जोड़ने के लिए, 0.1 एम NaCl में तार की स्थिति और 1.5-9 वी डीसी शक्ति के स्रोत के सकारात्मक टर्मिनल करने के लिए इलेक्ट्रोड धारक कनेक्ट. शक्ति के स्रोत के नकारात्मक टर्मिनल विद्युत 0.1 एम NaCl समाधान के लिए जोड़ा जाना चाहिए. Chloriding 10 मिनट के लिए आगे बढ़ना प्रतिक्रिया की अनुमति दें. रिकॉर्डिंग और संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच किसी भी स्थिर प्रभार बराबर है, संक्षेप में इलेक्ट्रोड को एक साथ स्पर्श रिकॉर्डिंग उपकरण पर उन्हें स्थापित करने से पहले.
- खींचो एक गिलास एक micropipette खींचने का उपयोग केशिका. केशिका की नोक पर खोलने के व्यास में 5-10 microns के आसपास होना चाहिए.
- एक हीरे की पेंसिल का प्रयोग करें स्कोर और बंद तोड़ने केशिका की कुंद अंत तो यह ~ 2 सेमी चांदी के तार से अधिक लंबी है. आग पॉलिश ब्यूटेन मशाल के साथ काट अंत.
- संशोधित घंटी समाधान में 0.5% agarose पिगलो. एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग कर इलेक्ट्रोड की टिप में पिघला हुआ agarose समाधान की एक छोटी राशि खींचो.
- केशिका के बारे में 1 / 2 संशोधित घंटी समाधान (एक सिरिंज कि गरम किया गया है और एक लंबे पतले अंत करने के लिए खींच लिया है इस उद्देश्य के लिए उपयोगी है) के साथ रास्ते से खींच भरें. धीरे से किसी भी हवाई बुलबुले को बेदखल करने के लिए केशिका झटका. नीचे में संशोधित घंटी समाधान की एक छोटी राशि के साथ भंडारण जार में भरा इलेक्ट्रोड स्टोर जब तक वे के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं. एक बार एक ऊतक का नमूना तैयार है और रिकॉर्डिंग के लिए तैयार है, रिकॉर्डिंग बिजली तार पर एक भरा केशिका स्थापित करें.
भाग 3: तैयारी odorant समाधान
odorants amyl एसीटेट और heptaldehyde बड़े प्रतिक्रियाओं का आह्वान और इस प्रकार सभी छवियाँ उत्तेजक के रूप में अच्छा विकल्प हैं.
- Microcentrifuge ट्यूबों में, डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में odorant के dilutions की एक श्रृंखला तैयार करते हैं. एक खुराक - प्रतिक्रिया वक्र के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, 5 एम से 5 से 10 गुना dilutions तैयार x 10 एम. -6 ताजा dilutions प्रत्येक दिन बनाओ.
- इसके अलावा odorants DMSO में 2 औंस की बोतल में 4.9 सिलिकॉन stoppers के साथ MLS पानी के साथ 100 μL पतला शेयर मिश्रण से पानी में 50 गुना पतला है. चलो समाधान कम से कम 30 मिनट के लिए बोतलों में संतुलित. ध्यान दें कि प्रत्येक बोतल में odorants वाष्प एकाग्रता अज्ञात है, लेकिन तरल चरण में odorants की एकाग्रता के एक समारोह के रूप में अलग अलग होंगे.
- सिलिकॉन डाट के माध्यम से दो 18 गेज सुई p सम्मिलित करेंrovide इनपुट और आउटपुट बंदरगाहों. बंदरगाहों जब बोतल से उपयोग में नहीं है खामियों को दूर किया जाना चाहिए.
भाग 4: सभी छवियाँ और विश्लेषण डेटा रिकॉर्डिंग
- सीओ 2 इच्छामृत्यु या संवेदनाहारी अधिक मात्रा शिरच्छेद द्वारा पीछा द्वारा एक माउस बलिदान. खोपड़ी overlying त्वचा निकालें और sagittally midline साथ सिर द्विविभाजित.
- सिर के एक आधा, औसत दर्जे का पक्ष बढ़ते डिश पर, माउंट. ध्यान पट हटाने के लिए turbinates बेनकाब.
- रिकॉर्डिंग मंच पर घुड़सवार ऊतक के साथ पकवान प्लेस. चरण संरेखित इतना है कि रिकॉर्डिंग के स्थान पर turbinates खुर्दबीन के नीचे केंद्रित है.
- हवा की टंकी पर मुड़ें turbinate सतह humidified हवा देने. स्थिति हवा डिलीवरी ट्यूब इतना है कि यह लगभग 10 मिमी रिकॉर्डिंग के स्थान से दूर है. प्रवाह दर ~ 600 एमएल / मिनट है.
- डीसी मोड (एसी प्रवर्धन सभी छवियाँ संकेत में कलाकृतियों को प्रेरित करेगा) 1 kHz पर कम पास फिल्टर, और 100X पर लाभ के साथ प्रवर्धक सेट करें.
- पर्वत और micromanipulators रिकॉर्डिंग संदर्भ इलेक्ट्रोड.
- कुएं में बढ़ते डिश पर संदर्भ इलेक्ट्रोड और निचले संशोधित घंटी ऐसी है कि यह विद्युत ऊतक से जुड़ा है समाधान के साथ कवर.
- Turbinate IIb या तृतीय की सतह पर ध्यान रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड कम. इलेक्ट्रोड बमुश्किल घ्राण उपकला की सतह को छूने चाहिए! जब इलेक्ट्रोड उपकला के साथ संपर्क में आता है (यानी एक बिजली के सर्किट को पूरा) एक सीधे आधारभूत आस्टसीलस्कप में दिखाई देगा.
- हवा वितरण ट्यूब पर बंदरगाह पक्ष के लिए एक odorant बोतल संलग्न.
- कंप्यूटर पर, एक उत्तेजना प्रोटोकॉल आरंभ. डाटा अधिग्रहण के लिए नमूना दर 2 kHz या अधिक होना चाहिए. सॉफ्टवेयर एक गंध पल्स ट्रिगर और रिकॉर्डिंग शुरू हो जाएगा.
- एक ठेठ उत्तेजना प्रोटोकॉल 100 - मिसे अवधि भी नाड़ी बनती 100 मिसे दालों एक 1 सेकंड अंतराल के द्वारा अलग, या एक 10 सेकंड निरंतर नाड़ी हो सकता है.
- ताकि ऊतक न्यूनतम अनुकूलित प्रोटोकॉल के बीच कुछ समय की अनुमति दें. एक मिनट amyl एसीटेट और 10 -3 एम अप heptaldehyde के तरल सांद्रता के लिए पर्याप्त है, उच्च सांद्रता में 5 मिनट की अनुमति है. उच्च गंध सांद्रता (जैसे एक खुराक - प्रतिक्रिया वक्र के अंत में) देने के बाद अवशिष्ट गंध ट्यूब में रह सकता है. 95% इथेनॉल के साथ हवा ट्यूब धो और सूखी अतिरिक्त ऊतकों के नमूनों के साथ जारी रखने से पहले.
- Axograph सॉफ्टवेयर सभी छवियाँ संकेत के मुख्य मापदंडों को मापने के लिए उपकरण प्रदान करता है है. इस तरह के मापदंडों प्रतिक्रिया आयाम, विलंबता, पीक करने के लिए समय और समाप्ति के समय स्थिरांक शामिल हैं. को डिजिटली 25 हर्ट्ज पर आगे के विश्लेषण से पहले निशान फ़िल्टर यह वांछनीय हो सकता है.
प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1. पैरामीटर का विश्लेषण सभी छवियाँ के लिए सभी छवियाँ के कई मापदंडों प्रतिक्रिया आयाम, विलंबता (जब उत्तेजना प्रशासित और प्रतिक्रिया शुरू होता है है के बीच का समय), समय वृद्धि (शुरू के बीच के समय सहित, चूहों के बीच प्रतिक्रियाओं की तुलना के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं. प्रतिक्रिया और चोटी के), पीक करने के लिए समय (उत्तेजना के शुरू से ही प्रतिक्रिया के शिखर समय), और लगातार समाप्ति के समय (τ, एक एकल घातीय समीकरण प्रतिक्रिया के क्षय चरण फिटिंग द्वारा निर्धारित ). विलंबता, वृद्धि समय और समाप्ति के निरंतर समय जैसे गतिज मानकों की तुलना के लिए, यह सलाह दी जाती है प्रतिक्रियाओं के शिखर आयाम विश्लेषण करने के लिए पहले मानक के अनुसार.
चित्रा 2. प्रतिनिधि अलग उत्तेजना प्रोटोकॉल के तहत संकेतों amyl एसीटेट की बढ़ती सांद्रता के साथ सभी छवियाँ (क) उत्तेजना के जवाब में एक माउस से EOGs के उदाहरण. पैनल के शीर्ष पर काला लाइन odorant उत्तेजना के समय की अवधि इंगित करता है. कथा में सांद्रता तरल समाधान की सांद्रता कर रहे हैं. (ख) एक खुराक - प्रतिक्रिया रिश्ता पांच चूहों से औसतन. त्रुटि सलाखों के 95% विश्वास अंतराल हैं. शिखर आयाम में गिरावट अक्सर बहुत उच्च गंध सांद्रता में मनाया जाता है. (ग) बनती नाड़ी उत्तेजना के जवाब में सभी छवियाँ का एक उदाहरण है. Odorant की एक एकल कम नाड़ी कई सेकंड के लिए स्थायी अनुकूलन elicits. (घ) एक 10 - सेकंड के जवाब में सभी छवियाँ का एक उदाहरण odorant उत्तेजना निरंतर. सभी छवियाँ निरंतर odorant प्रस्तुति के दौरान desensitization से पता चलता है.
Discussion
इस प्रोटोकॉल में वर्णित सेटअप के साथ, घ्राण उपकला की सतह पर odorant उत्तेजनाओं ऊतक की तैयारी के बीच लगातार हो सकता है, जंगली और प्रकार उत्परिवर्ती चूहों के बीच तुलना के लिए अनुमति देता है, भले ही सटीक odorant एकाग्रता और गतिशीलता से अनजान हैं. कई कारकों, विशेष रूप से रिकॉर्डिंग स्थान और humidified हवा के प्रवाह की दर, सभी छवियाँ में बदलाव के कारण. केयर वही turbinate पर इसी तरह की स्थिति से रिकॉर्ड करने के लिए भिन्नता को कम से कम करने के लिए लिया जाना चाहिए. यह आसानी से लगातार सिर के एक ही पक्ष से रिकॉर्डिंग और माइक्रोस्कोप, गंध वितरण ट्यूब, और ऊतकों के नमूनों के बीच हवा अपरिवर्तित तालिका पर micromanipulators के पदचिह्न रखने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, ऊतकों के नमूनों तुरंत humidified हवा की धारा में रखा जाना चाहिए विच्छेदन के बाद ऊतक के अत्यधिक सुखाने को रोकने के लिए.
चूहों पर सभी छवियाँ रिकॉर्डिंग भी तैयार माउस पर एक तरल छिड़काव तंत्र के साथ बाहर कर सकते हैं किया जा 7, 14, 15, या सिर बरकरार छोड़ने और turbinates 16, 17 के ऊपर एक छोटे से छेद drilled में इलेक्ट्रोड डालने से turbinates. सभी छवियाँ रिकॉर्डिंग के प्रत्येक बदलाव की अपनी ताकत है: ऊतक के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित तैयारी पर हवा चरण रिकॉर्डिंग सेटअप की एक न्यूनतम राशि की आवश्यकता होती है और आसान आचरण रहे हैं, एक तरल छिड़काव तंत्र का उपयोग करते हुए रिकॉर्डिंग औषधीय अभिकर्मकों के उपयोग की सुविधा है, हालांकि कई odorants के हाइड्रोफोबिक प्रकृति गंध डिलीवरी पेचीदा हो, अंत में, रिकॉर्डिंग में जो सिर बरकरार रह गया है, 'कृत्रिम सूंघ' प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट जब turbinates पूरी तरह से उजागर कर रहे हैं की तुलना में अधिक मुश्किल है.
Disclosures
चूहे को संभाला और पशु और जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय की देखभाल का प्रयोग करें समितियों द्वारा अनुमोदित विधियों के साथ euthanized थे.
Acknowledgments
हम डॉ. Yijun गाने, और Hattar Kuruvilla झाओ त्रिकोणीय जीवविज्ञान विभाग, सलाह और मदद के लिए जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय के प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देता हूं. एनआईएच DC007395 और DC009946 अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air delivery tube | equipment | Custom Made | The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute | |
| Air table | equipment | Newport Corp. | LW3030B-OPT | |
| Amplifier | equipment | Warner Instruments | DP-301 | |
| Computer and Data Acquisition Software | equipment | Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh | Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/. | |
| Butane torch | equipment | A crème brûlèe torch works well | ||
| Digitizer | equipment | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Dissecting Scope | equipment | Scienscope | SSZ | |
| Electrode holder | equipment | Harvard Apparatus | 64-1021 | |
| Magnetic Holding Devices (12 mm) | equipment | World Precision Instruments, Inc. | M10 | |
| Micromanipulators | equipment | World Precision Instruments, Inc. | M3301R M3301L | |
| Micropipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P2000 | |
| Oscilloscope | equipment | Tektronix, Inc. | 5110 | |
| Picospritzer III | equipment | Parker Hannifin Corporation | ||
| Silicone tubing | equipment | Nalge Nunc international | ||
| Specimen stage | equipment | Custom Made | Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay. | |
| 18 gage needles | material | BD Biosciences | 305195 | |
| 2 oz. glass bottles | material | VWR international | 16152-201 | |
| Glass capillaries | material | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-6 | |
| Silicone stoppers size 16D | material | Chemware | D1069809 | |
| Silver wire | material | World Precision Instruments, Inc. | AGW1010 | |
| SylGuard 184 | material | Dow Corning | SYLG184 | From World Precision Instruments |
| Agarose | reagent | Invitrogen | 15510-027 | |
| Amyl acetate | reagent | Aldrich | W504009 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | reagent | Sigma-Aldrich | C-1016 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | reagent | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| HEPES | reagent | Fisher Scientific | BP310 | |
| Heptaldehyde | reagent | Aldrich | H2120 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O) | reagent | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Sodium chloride (NaCl) | reagent | JT Baker | 3624-05 | |
| flowmeter | equipment | Gilmont Instruments | GF-2260 |
References
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