Summary
O electroolfactogram gravação (EOG) é uma maneira informativa de fácil condução e confiável de avaliação da função olfativa ao nível do epitélio olfativo. Este protocolo descreve uma configuração de gravação, de preparação dos tecidos mouse, coleta de dados e análise de dados básicos.
Abstract
Animais dependem do olfato para muitos comportamentos críticos, tais como encontrar fontes de alimentos, evitar predadores, ea identificação de membros da mesma espécie para acasalamento e outras interações sociais. O electroolfactogram gravação (EOG) é um método informativo, fácil de conduzir, e de confiança para a função teste olfativo no nível do epitélio olfativo. Desde a descrição de 1956 do EOG por Ottoson em rãs 1, a gravação EOG tem sido aplicado em muitos vertebrados, incluindo salamandras, coelhos, ratos, camundongos e humanos (revisado por Scott e Scott-Johnson, 2002, ref. 2). Os recentes avanços na modificação genética em camundongos reacenderam o interesse pela gravação do EOG para a caracterização fisiológica da função olfativa em knock-out e knock-em camundongos. EOG gravações têm sido aplicados com sucesso para demonstrar o papel central das componentes de sinal olfativo de transdução de 3-8, e mais recentemente para caracterizar a contribuição de certos mecanismos de regulação de respostas OSN 12/09.
Detecção de odores ocorre na superfície do epitélio olfativo sobre os cílios de ORS, onde uma cascata de transdução de sinal leva à abertura de canais iônicos, gerando uma corrente que flui para os cílios e despolariza a membrana 13. O EOG é o potencial negativo registrado extracelularmente na superfície do epitélio olfativo com a estimulação odorant, resultante de um somatório das mudanças potenciais causados pela individuais ORS resposta no campo de gravação 2. Comparação da amplitude e da cinética do EOG, assim, fornecer informações valiosas sobre como modificação genética e outras manipulações experimentais influenciam a sinalização molecular subjacente a resposta à OSN odor.
Aqui nós descrevemos uma gravação EOG ar-fase em uma preparação de cornetos rato olfativo. Resumidamente, depois de sacrificar o rato, o cornetos olfativos são expostos por bisecting a cabeça ao longo da linha média e remoção do septo. A preparação concha é então colocada na configuração de gravação, e um eletrodo de gravação é colocado na superfície do epitélio olfativo em uma das conchas nasais medial. Um eletrodo de referência é eletricamente conectada ao tecido através de uma solução tampão. Um fluxo contínuo de ar umidificado é soprado sobre a superfície do epitélio para mantê-lo úmido. O vapor de soluções odorant é soprado para a corrente de ar umidificado para estimular o epitélio. Respostas são gravadas e digitalizadas para posterior análise.
Protocol
Parte 1. A configuração de gravação EOG
O aparelho de gravação consiste de um eletrodo de registro, eletrodo de referência, tubo de ar, estágio da amostra, e microscópio de dissecação, tudo ancorado em uma mesa de ar dentro de uma gaiola de Faraday. Micromanipuladores são usadas para a colocação dos eletrodos e do tubo de entrada de ar. A corrente de ar contínua é borbulhar na água destilada para adicionar umidade antes de passar através do tubo de vazão de ar e sobre a amostra. A placa de cultura 60 milímetros cheio de Sylgard a uma profundidade de 6-8 mm é usada como uma superfície de montagem para a amostra. Um bem e um canal são esvaziadas do Sylgard no prato de montagem para fornecer um meio para conectar eletricamente o eletrodo de referência com o modelo modificado através de solução de Ringer.
O eletrodo de registro eo eletrodo de referência são conectados a um amplificador. Sinais do amplificador são enviados para um digitalizador e, em seguida, a um computador. Software, tais como Axograph ou pClamp pode ser usado para controlar o protocolo de estimulação, para gravar o sinal, e para posterior análise das respostas. Um osciloscópio conectado após o amplificador pode ser conveniente para monitoramento em tempo real do potencial elétrico ao colocar o eletrodo de gravação e durante as gravações EOG.
Entrega de estímulos olfativos é controlado por um Picospritzer, que é conectado ao mesmo computador usado para a aquisição de sinal. A pressão do ar no Picospritzer está definido para 10 psi. Um único tanque de ar e regulador pode ser usado para suprimento de ar para o ar tanto tabela eo Picospritzer. Um segundo tanque de ar e regulador é usado para fornecer ar para a corrente de ar umidificado, pois isso requer uma pressão mais baixa e uma grande quantidade de fluxo de ar. Pouco antes de entregar um estímulo odorante, a saída Picospritzer está conectado a uma garrafa de odores. A garrafa odorant é então ligado ao tubo de ar.
Parte 2: Preparando-se eletrodos
O eletrodo de gravação é um fio de prata chlorided em um copo puxado capilar preenchido com solução de Ringer modificado (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, pH 7,4, esterilizado por filtração). O eletrodo de referência é um fio de prata chlorided.
- Instale fio de prata no porta-eletrodo. Para o eletrodo de registro, de um a dois centímetros de fio devem se projetar a partir do fim do suporte do eletrodo. Mais fio pode ser deixado para o eletrodo de referência.
- Para adicionar o casaco AgCl para o fio de prata, a posição do fio em 0,1 M NaCl e ligue o suporte do eletrodo para o terminal positivo de uma fonte de energia 1,5-9 V DC. O terminal negativo da fonte de alimentação deve ser eletricamente conectados à solução de NaCl 0,1 M. Permitir que a reação chloriding para continuar por 10 minutos. Para equalizar a carga estática entre a gravação eo eletrodo de referência, brevemente os eletrodos juntos antes de instalá-los no aparelho de gravação.
- Puxar um capilar de vidro usando um extrator micropipeta. A abertura na ponta do capilar deve ser em torno de 10/05 microns de diâmetro.
- Use um lápis de diamante para marcar e quebrar o fim brusco do capilar por isso é ~ 2 cm maior do que o fio de prata. -Fogo polonês a extremidade cortada com a tocha butano.
- Melt agarose 0,5% em solução de Ringer modificado. Puxe uma pequena quantidade de solução de agarose derretida na ponta do eletrodo usando uma pipeta.
- Preencher o capilar puxado aproximadamente 1 / 2 do caminho com solução de Ringer modificado (uma seringa que foi aquecido e puxado para ter um final longo e fino é útil para esta finalidade). Agite suavemente o capilar para desalojar as bolhas de ar. Armazenar o eletrodo cheia no frasco de armazenamento com uma pequena quantidade de solução de Ringer modificado no fundo até que estejam prontos para serem usados. Uma vez que uma amostra de tecido é preparado e pronto para a gravação, instale um capilar preenchido ao longo do fio eletrodo de registro.
Parte 3: Preparar soluções odorant
O acetato de amila odores e heptaldehyde evocam respostas grandes e, assim, são escolhas boas como estimulantes EOG.
- Em tubos de microcentrífuga, preparar uma série de diluições de odores em dimetil sulfóxido (DMSO). Como ponto de partida para uma curva dose-resposta, prepare-10 diluições de 5 M para 5 x 10 -6 M. Fazer diluições fresco todos os dias.
- Diluir ainda mais o odorants 50 vezes na água misturando 100 mL de ações diluídas em DMSO com 4,9 ml de água em duas garrafas com rolhas de silicone onça. Deixe as soluções equilibrar nas garrafas por pelo menos 30 minutos. Note que a concentração de vapor de odorante em cada garrafa é desconhecida, mas pode variar em função da concentração de odorante na fase líquida.
- Coloque duas agulhas calibre 18, através da rolha de silicone para provide portas de entrada e de saída. As portas devem ser ligados quando a garrafa não estiver em uso.
Parte 4: Gravação dos dados e análise de EOG
- Sacrificar um rato por CO 2 ou a eutanásia overdose anestésico seguido de decapitação. Retire a pele que cobre o crânio e sagital bisect a cabeça ao longo da linha média.
- Monte uma metade da cabeça, lado medial para cima, sobre o prato de montagem. Remova cuidadosamente o septo para expor os cornetos.
- Coloque o prato com tecido montada no palco de gravação. Alinhar o palco para que o local de gravação na cornetos está centrada sob o microscópio.
- Ligue o tanque de ar para fornecer ar umidificado à superfície da concha. Posicione o tubo de ar de modo que é de aproximadamente 10 mm de distância do local de gravação. A vazão é de aproximadamente 600 mL / min.
- Definir o amplificador para o modo DC (amplificação AC irá induzir artefatos no sinal de EOG) com filtro passa-baixa a 1 kHz, e ganho em 100X.
- Montagem de gravação e eletrodos de referência na micromanipuladores.
- Inferior o eletrodo de referência dentro do poço sobre o prato de montagem e cobrir com solução de tal forma que é eletricamente conectada ao tecido modificado Ringer.
- Cuidadosamente abaixe o eletrodo de registro na superfície do corneto IIb ou III. O eletrodo mal deve tocar a superfície do epitélio olfativo! Quando o eletrodo entra em contato com o epitélio (isto é, completa um circuito elétrico) uma linha de base reta aparecerá no osciloscópio.
- Anexar uma garrafa odorant à porta lateral do tubo de ar.
- No computador, iniciar um protocolo de estimulação. A taxa de amostragem para aquisição de dados deve ser de 2 kHz ou superior. O software irá desencadear um impulso de odor e começar a gravar.
- Um protocolo de estimulação típico pode ser de 100 ms duração do pulso único, emparelhado 100-msec pulsos separados por um intervalo de 1 seg, ou a 10 seg de pulso sustentado.
- Dar algum tempo entre os protocolos de modo que o tecido é minimamente adaptadas. Um minuto é suficiente para as concentrações de líquido de acetato de amilo e heptaldehyde até 10 M -3; em concentrações mais elevadas permitem que 5 minutos. Depois de entregar as concentrações de odor alta (como no final de uma curva dose-resposta) odor residual pode permanecer no tubo. Lave o tubo de ar com 95% de etanol e seco antes de continuar com amostras de tecido adicional.
- Axograph software oferece ferramentas para medir os parâmetros-chave do sinal de EOG. Tais parâmetros incluem a amplitude de resposta, latência, tempo de pico, e constantes de tempo da rescisão. Pode ser desejável para digitalmente filtro de traços a 25 Hz antes de uma análise mais aprofundada.
Resultados representante
Figura 1. Parâmetros para EOG análise. Vários parâmetros do EOG são particularmente úteis para a comparação de respostas entre os ratos, incluindo a amplitude da resposta, a latência (o tempo entre quando o estímulo é administrado ea resposta começa), aumento do tempo (o tempo entre o início da resposta eo pico), tempo de pico (o tempo desde o início do estímulo até o pico da resposta), e constante de tempo de terminação (τ, determinado pelo ajuste a fase de decadência da resposta a uma única equação exponencial ). Para a comparação dos parâmetros cinéticos, tais como latência, tempo de subida, e constante de tempo de terminação, é aconselhável para normalizar a amplitude do pico das respostas antes da análise.
Figura 2. Representante EOG sinais em diferentes protocolos de estimulação. (A) Exemplos de EOGs de um camundongo em resposta à estimulação com concentrações crescentes de acetato de amila. A linha preta na parte superior do painel indica o momento ea duração do estímulo odorante. As concentrações na legenda são as concentrações da solução líquida. (B) A relação dose-resposta em média de cinco camundongos. Barras de erro são os intervalos de confiança de 95%. Um declínio na amplitude de pico é freqüentemente observado em concentrações odor muito alto. (C) Um exemplo de um EOG em resposta a um estímulo emparelhado pulso. Um único pulso curto de odorant provoca adaptação com duração de vários segundos. (D) Um exemplo de um EOG em resposta a uma de 10 seg sustentada estímulo odorante. O EOG dessensibilização mostra durante a apresentação odorant contínua.
Discussion
Com a configuração descrita neste protocolo, os estímulos olfativos na superfície do epitélio olfativo será consistente entre preparações de tecido, permitindo a comparação entre o tipo selvagem e ratos mutantes, embora a concentração de odores e dinâmica exata é desconhecida. Vários fatores, especialmente a localização de gravação ea taxa de fluxo de ar umidificado, causam variações na EOG. Cuidados devem ser tomados para gravar a partir de posições semelhantes sobre o corneto mesmo para minimizar a variação. Isto pode ser facilmente alcançado de forma consistente a gravação do mesmo lado da cabeça e manter a pegada do microscópio, tubo de odor, e micromanipuladores sobre a mesa de ar inalterada entre amostras de tecido. Além disso, amostras de tecido deve ser colocado imediatamente no fluxo de ar umidificado após a dissecção para evitar a secagem excessiva do tecido.
EOG gravações em ratos também podem ser realizadas com um aparelho de perfusão de líquido no mouse preparado cornetos 7, 14, 15, ou deixando a cabeça intacta e inserindo o eletrodo em um pequeno buraco perfurado acima dos cornetos 16, 17. Cada variação de gravação EOG tem suas próprias forças: ar-fase gravações em preparações de tecido, conforme descrito neste protocolo requer uma quantidade mínima de instalação e são mais fáceis de conduta; gravações usando um aparelho de perfusão de líquidos facilitar o uso de reagentes farmacológicas, embora o natureza hidrofóbica de odores muitas complica entrega odor, por último, as gravações em que o chefe é deixada intacta pode ser usado em 'artificial sniff' experimentos, embora a colocação do eletrodo é mais difícil do que quando os cornetos estão totalmente expostos.
Disclosures
Camundongos foram tratados e sacrificados com os métodos aprovados pelo Animal Care e Comitês Uso do The Johns Hopkins University.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Canção Yijun, e membros da Kuruvilla Hattar Zhao tri-laboratório do Departamento de Biologia, da Universidade Johns Hopkins para aconselhamento e ajuda. Suportado pelo NIH concede DC007395 e DC009946.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air delivery tube | equipment | Custom Made | The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute | |
| Air table | equipment | Newport Corp. | LW3030B-OPT | |
| Amplifier | equipment | Warner Instruments | DP-301 | |
| Computer and Data Acquisition Software | equipment | Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh | Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/. | |
| Butane torch | equipment | A crème brûlèe torch works well | ||
| Digitizer | equipment | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Dissecting Scope | equipment | Scienscope | SSZ | |
| Electrode holder | equipment | Harvard Apparatus | 64-1021 | |
| Magnetic Holding Devices (12 mm) | equipment | World Precision Instruments, Inc. | M10 | |
| Micromanipulators | equipment | World Precision Instruments, Inc. | M3301R M3301L | |
| Micropipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P2000 | |
| Oscilloscope | equipment | Tektronix, Inc. | 5110 | |
| Picospritzer III | equipment | Parker Hannifin Corporation | ||
| Silicone tubing | equipment | Nalge Nunc international | ||
| Specimen stage | equipment | Custom Made | Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay. | |
| 18 gage needles | material | BD Biosciences | 305195 | |
| 2 oz. glass bottles | material | VWR international | 16152-201 | |
| Glass capillaries | material | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-6 | |
| Silicone stoppers size 16D | material | Chemware | D1069809 | |
| Silver wire | material | World Precision Instruments, Inc. | AGW1010 | |
| SylGuard 184 | material | Dow Corning | SYLG184 | From World Precision Instruments |
| Agarose | reagent | Invitrogen | 15510-027 | |
| Amyl acetate | reagent | Aldrich | W504009 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | reagent | Sigma-Aldrich | C-1016 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | reagent | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| HEPES | reagent | Fisher Scientific | BP310 | |
| Heptaldehyde | reagent | Aldrich | H2120 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O) | reagent | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Sodium chloride (NaCl) | reagent | JT Baker | 3624-05 | |
| flowmeter | equipment | Gilmont Instruments | GF-2260 |
References
- Ottoson, D. Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium. Acta Physiologica Scandinavica. 35, Suppl 122. 1-83 (1956).
- Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. The electroolfactogram: a review of its history and uses. Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20, 69-81 (1998).
- Zhao, H. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279, 237-242 (1998).
- Wong, S. T. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27, 487-497 (2000).
- Munger, S. D. Central role of the CNGA4 channel subunit in Ca2+-calmodulin-dependent odor adaptation. Science. 294, 2172-2175 (2001).
- Michalakis, S. Loss of CNGB1 protein leads to olfactory dysfunction and subciliary cyclic nucleotide-gated channel trapping. J Biol Chem. 281, 35156-35166 (2006).
- Buiakova, O. I. Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9858-9863 (1996).
- Nickell, W. T., Kleene, N. K., Gesteland, R. C., Kleene, S. J. Neuronal chloride accumulation in olfactory epithelium of mice lacking NKCC1. J Neurophysiol. 95, 2003-2006 (2006).
- Song, Y. Olfactory CNG channel desensitization by Ca2+/CaM via the B1b subunit affects response termination but not sensitivity to recurring stimulation. Neuron. 58, 374-386 (2008).
- Cygnar, K. D., Zhao, H. Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons. Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem Senses. 33, 839-859 (2008).
- Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors". J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).
- Pinato, G. Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice. Chem Senses. 33, 397-404 (2008).
- Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W. Regional distribution of rat electroolfactogram. J Neurophysiol. 73, 2207-2220 (1995).
- Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. Effects of air flow on rat electroolfactogram. Chem Senses. 25, 761-768 (2000).
