Summary
쥐 MSCS는 대퇴골과 tibias으로부터 격리하고 자기 세포 분류에 의해 풍부하게되었다. 정렬 세포 유동세포계측법에 의해 표면 마커의 표현에 대해 확인했다. 이러한 세포는 하나의 식민지를 형성 clonal 밀도에 교양 있었다 그리고 이들 식민지는 복제 실린더로 구분했다.
Abstract
MSCS는 치료 어플 리케이션을위한 유망한 원천이다 성인 줄기 세포의 인구입니다. 이러한 세포는 골수에서 격리 수 있으며, 쉽게 플라스틱 준수로 인해 조혈 줄기 세포 (HSCs)에서 분리될 수있다. 이 프로토콜은 쥐 대퇴골과 tibias에서 MSCS를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. 분리된 세포는 더욱 자기 셀 정렬하여 두 MSCS 표면 마커 CD54과 CD90에 대한 풍부한되었습니다. 표면 마커 CD54과 CD90의 표현은 다음 유동세포계측법 분석에 의해 확인되었다. HSC 마커 CD45도 정렬 MSCS가 HSCs의 소진되었습니다 있는지 확인하기 위해 포함되었습니다. MSCS 자연 매우 이질 있습니다. 다른 형태, 증식 및 분화 능력을 가지고 세포의 subpopulations가 있습니다. 이러한 subpopulations는 모든 알려진 MSCS의 마커를 표현하고 더 독특한 마커는 아직 다른 subpopulations에 대한 확인되지 않았습니다. 따라서, 다른 subpopulations을 분리하는 대체 방법은 단일 식민지 파생 세포를 분리하는 복제 실린더를 사용하고 있습니다. 단일 식민지에서 파생된 세포는 다음 교양하고 별도로 평가하실 수 있습니다.
Protocol
1. 쥐 MSCS의 분리
Mesenchymal 줄기 세포는 이전에 다음 ID로 한 설명된대로 6-8주 오래된 스프 라그 - 돌리 좋아하지, 2 고립되었다. 절연 MSCS 플라스틱 표면을 준수하고 쉽게 체외 문화 중에 확장할 수 있습니다.
- 동물은 마취 챔버에 넣고 약 5 분 동안 anaesthetized했다. 마취 동안, 점멸, 호흡 및 운동 활동의 속도를 관찰합니다. 그것이 모터의 활동을 중지하고 깜빡 속도가 드문가 된 후 즉시 챔버에서 동물을 제거합니다.
- 작업 역에있는 동물을 버리고, 경추 전위에 의해 동물을 죽이지. 다시 사지에서 대퇴골과 tibias 잘라, 피부와 근육을 제거하십시오.
- 몇 초 동안 이소프로판올 70%에서 해부하는 대퇴골과 tibias를 넣고 1X D - PBS로 전송할 수 있습니다.
- biosafety 캐비닛에서 대퇴골과 tibias는 DMEM을 포함 10cm 요리로 전송되었습니다. 각 뼈가 다음 핀셋 개최되었고 두 끝을는 가위로 잘라 오픈되었습니다. 3ml 주사기에 22G 바늘을 첨부하여 DMEM로 작성 후 뼈 중 하나 열 끝에 바늘을 삽입하여 50ml 튜브에 골수를 플러시. ~ 3 번 각각의 뼈에 반복 2. 모든 marrows가 취득되었을 때, 세포를 resuspend과 뼈가 파편과 혈액 집계를 제거하는 70μm 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다.
- 200g에 세포를 5 분 동안 4 ° C를 스핀 다운과 열망에 의해 표면에 뜨는를 제거합니다. 25ml MSC 매체에서 Resuspend 세포 (DMEM 10 % FBS, 1 % 펜 - Strep을 포함). 10ml의 세포 현탁액은 두 요리의 총 각 10cm 문화 요리에 씨앗을했다. 1 ~ 2 주 동안 37 ° C와 5% CO 2 배양기에서 문화 요리 보관하십시오. 매체는 2 ~ 3 일마다 변경되었습니다.
2. 쥐 MSCS의 농축
표면 단백질의 숫자는 CD54, CD90, CD73, CD105 CD271과 3-5를 포함하여 MSCS를 풍요롭게하는 데 사용되었습니다. 우리의 연구에서는, 우리는 자기 세포 정렬하여 MSCS를 풍부하게하는 표지로서 CD54과 CD90를 사용합니다.
- 세포 confluency 80 % 정도에 도달하면 매체를 대기음 각 접시에 4 ~ 5ml 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가합니다. 인큐베이터에 다시 요리를 넣고 세포 분리를 허용 5 분 동안 주변에 알을 품다. 일단 세포가 분리 트립신을 inactivate하는 문화 매체의 동일한 금액을 추가했다. 5 분 4 ° C, 200g에 15ml 튜브와 스핀 다운 세포에 세포 현탁액를 수집합니다.
- 다음 단계는 BD IMagnet를 사용하여 세포 분리를위한 매뉴얼에 따라 두 표면 마커 CD54과 CD90에 의해 MSCS를 풍요롭게하는 방법에 대해 설명합니다. 세포 펠렛은 20,000,000 셀 / ML에서 세포 얼룩 버퍼 (1X D - PBS에서 3% 열 inactivated FBS)에 resuspended되었습니다. Biotinylated CD54 항체 (0.25μg 만명 당 세포)와 biotinylated CD90 항체가 (만 셀 당 0.15μg) 추가 및 세포 현탁액로 부드럽게 혼합했다. 15 분 동안 얼음에 부화 후, 표시된 전지 1X BD IMag 버퍼의 초과 볼륨 세탁했다. 분류 세포는 5 분, 4 ° C 200g에 아래 소용되었다.
- 소용돌이 BD IMag streptavidin 입자 철저하게 모든 10000000 전지 40μl 입자를 추가합니다. 철저하게 표시된 세포와 입자를 섞어하고 ~ 12 ° C 30 분 6 세포를 품어. 이것은 streptavidin 입자에 바인딩할 수 있도록 각각 표면 단백질 CD54과 CD90에 바인딩되어있는, biotinylated 안티 CD54 및 안티 CD90.
- 배양 시간 동안 긍정적인 분수를 수집하는 왕복 바닥 시험관에 라벨을 달고. 부화 후, 1X BD IMag 버퍼와 20000000 세포 / ML에 상표 볼륨을 가지고 있고 긍정 - 분수 수집 튜브에 표시된 세포를 전송합니다. BD IMagnet에 긍정적인 - 분수 튜브를 삽입 6 분 후, BD의 IMagnet 여전히 긍정적 - 분수 튜브와 유리 파스퇴르 피펫으로 뜨는을 제거 그것이가요.
- BD의 IMagnet에서 긍정 - 분수 튜브를 제거하고 얼음에 놓으십시오. 1ml 얼음 차가운 1X BD IMag 버퍼와 부드러운 혼합하여 resuspend 세포를 추가합니다. BD IMagnet에 다시 튜브를 삽입하고 2 ~ 4 분 동안 머물게. 새로운 유리 파스퇴르 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 2.5 한 번만 더에서 설명한대로 세탁을 반복합니다.
- 문화 매체의 BD IMagnet과 resuspend 세포, 씨앗 하나 셀 및 유동세포계측법에 10cm의 접시를 유지하기위한 75cm 두 플라스크에서 튜브를 제거합니다.
3. 유동세포계측법에 의해 표면 마커의 표현의 확인
유동세포계측법 분석은 우리가 표현 CD54과 CD90를 얻은 세포를 확인하기 위해 수행되었다. HSC 마커 CD45는 MSCS가 HSCs의 소진 것을 확인하기 위해 사용되었다.
- 세포 ~ 80 %의 합류가 될 때, 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 세포를 trypsinize하고 15ml 튜브에 세포를 수집합니다. ° C 5 분 동안 세포를 수집 200g, 4 원심 분리기.
- 뜨는을 대기음 있었고한번 1X PBS로 D - H 세포. 5 최종 농도 ~ 10000000 세포 / ML하고 얼음에 세포를 유지 세포 얼룩 버퍼에 Resuspend 세포 (1X D - PBS가 2퍼센트 FBS와 0.05 %의 나트륨 azide를 포함). (., 2 isotype 제어 IgG2a,.. 3 Isotype IgG1 제어, 4 CD45, 5. CD54,.. 6 CD90 세포 하나에만 해당) 여섯 표시 튜브로 나누어지는 100μl 세포 현탁액.
- (:; : 0.5μg 만명 당 세포, CD54 : 0.25μg 만명 당 세포, CD90 : CD45 20μl 만명 당 세포 IgG2a 및 IgG1 0.15μg 만명 당 세포) 적절한 농도에 isotype 컨트롤 및 기본 항체를 추가하고 4 ° C에서 알을 품다 30 분 정도.
- 100μl 세포 얼룩 버퍼에 두번 후 resuspend 세포 1X D - PBS로 세포를 씻으십시오. SA - PE (streptavidin - phycoerythrin, 만 셀 당 0.15μg를 사용)을 추가하고 4 품어 ° C를 어둠 속에서 30 분.
- 두번 1X D - PBS로 표시된 세포를 씻으십시오. 400μl 세포 얼룩 버퍼에있는 세포를 Resuspend하고 유동세포계측법 분석을위한 팔콘 튜브로 전송할 수 있습니다.
4. MSCS를 유래 단일 식민지의 분리
MSCS 다른 세포 형태, 성장 속도뿐만 아니라 차별화 능력 6 가지 subpopulations 구성된 이기종 인구입니다. 그러나, 모든 subpopulations는 알려진 MSC 마커를 표현하기 때문에 그것이 subpopulations을 구분하는 마커를 사용 가능하지 않습니다. 따라서, 우리는 하나의 세포에 의해 형성된 콜로니의 다른 subpopulations를 따로 떼어 복제 실린더를 적용.
- 10cm 접시 당 약 50 ~ 100 세포에서 플레이트 세포. 1 ~ 2 주 동안 37 ° C와 5% CO 2 배양기에서 알을 품다. 이 기간 동안 거꾸로 현미경으로 잘 격리 식민지를 확인합니다. 식민지가 충분히 큰 크기 (더 나은 각 식민지에 100 개 이상의 세포)에 도달되면, 요리의 하단에 샤피로 식민지를 표시합니다. 표시하기 위해 식민지를 선택하면, 선택한 한 근처 둘러싼 식민지가없는 있는지 확인하십시오.
- 매체 기음과 1X PBS로 D - 번 접시를 씻으십시오. 멸균 포셉와 살균 복제 실린더를 들고 부드럽게 표시 식민지 주위를 놓으십시오. 모두 표시 식민지 이상 배치 복제 실린더를 때까지이 과정을 반복합니다. 선택한 식민지 모든 복제 실린더가 하나의 식민지를 포함 각 등에서 멀리 떨어져 있어야합니다.
- 각 복제 실린더에 100μl 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가하고 ~ 5 분 동안 인큐베이터에 다시 접시를 넣어. 5 분 후에, 그들이 돌고 있습니다 여부를 확인하기 위해 현미경으로 세포를 확인하십시오. 세포가 해제되면 트립신을 inactivate하는 문화 매체의 동일한 금액을 추가합니다. 200μl micropipettor으로 세포 현탁액을 혼합하고 3ml prewarmed 문화 매체를 포함하는 60mm 접시에 세포 현탁액을 전송할 수 있습니다. 제대로 요리를 라벨과 보육로 다시 넣어. 앞으로 몇 일 동안 형태학의 변화를 추적.
5. 대표 결과
쥐 MSCS 절연에 대한 부분에서 설명하는 프로토콜에 따라, 플라스틱 자기편 MSCS는 도금 후 다음날 표시해야합니다. 세포가 세포 분열 따위에 의해 번식을 계속로서, 합류 전지는 그림 1A에 표시된 셀에 같이한다. 세포에 도달하면 ~ confluency 80 % (그림 1B), subculturing이 수행하실 수 있습니다. subculture 동안, 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)은 세포를 분리하기 위해 사용되며 그림 1C 같이 해제 세포가 작고 둥근되었습니다.
그림 1. 쥐 MSCS의 위상 콘트라스트 이미지를 표시합니다. (A) 콘플루앙 MSCS. 세포의 대다수는 스핀들과 같은, 별 같은 수 있습니다. (B) MSCS 80 % 정도 confluency. (C) trypsinization 후 찾았 는데요 세포가 작고 둥근 있습니다.
일단 MSCS가 자기 세포 분류에 의해 강화되고 유동세포계측법 분석은 표면 표시자 표현식을 확인하기 위해 수행됩니다. 농축 좋은 경우, 세포는 HSC 마커 CD45 (그림 2)에 대한 긍정적인 MSC 표시 CD54과 CD90에 대한 얼룩하지만 부정을 표시한다. Isotype 컨트롤 IgG2a과 IgG1은 부정적인 컨트롤로 사용됩니다.
그림 2. 표면 마커에 대한 MSCS의 유동세포계측법 분석. MSCS는 IgG2a (isotype 제어 1), IgG1 (isotype 제어 2), CD45, CD54과 CD90에 대한 항체로 분류되었습니다. MSCS는 CD54과 CD90를 표현하지만 CD45.
세포가 적절한 clonal 밀도에 씨앗을 때, 식민지는 단일 세포에서 증가한다. 그림 3A는 하나의 세포에 의해 형성된 식민지를 나타냅니다. 복제 실린더는 다음 식민지에서 파생된 식민지와 세포가 별도로 양식 수있는 별도의하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 3B와 3C는 두 개별 식민지에서 파생된 세포를 나타냅니다. 식민지 2에서 파생된 세포 (그림 3C) 라운드 반면 콜로니 1에서 파생된 세포는 같은 스핀들 (그림 3B)입니다.
그림 3. MSCS와 단일 콜로니 파생 세포 콜로니 형성. MSCS는 clonal 밀도 양식 개별 식민지에서 교양. 이들 식민지는 별도 양식 수있는 복제 실린더와 다른 식민지에서 세포로 구분하실 수 있습니다. clonal 밀도에 도금하면 (A) 대표 식민지가 MSCS에 의해 형성. (B) 1 식민지에서 파생된 세포를 스핀들과 같은. (C) 라운드 전지는 다른 식민지에서 파생.
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Discussion
이 프로토콜은 격리와 MSCS를 풍요롭게하는 방법에 대해 설명합니다. 단일 식민지 파생 세포를 분리하는 방법도 포함될 수 있습니다. 성공적인 고립, 농축 및 식민지 분리에 중요한 몇 가지 단계가 있습니다. 쥐의 세포에서 분리하고 있지만, 그것은 셀 스트레이너 또는 혈전과 뼈 파편 제거와 비슷한 크기의 살균 나일론 메쉬를 통해 필터 권장합니다. 하룻밤 세포를 도금 후, 많은 죽은 세포는 매체 부동되고 죽은 세포가 부착된 세포의 성장을 도움이 될 것입니다 새로운 매체로 대체하여 제거됩니다.
이 프로토콜의 정렬 자기 세포는 긍정적인 선택을 수행하는 방법을 설명하고, 이와 유사한 절차는 부정적인 선택을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 추가되는 항체의 양이 다를 수 있으며 최적화는 더 나은 정렬을 달성하기 위해 필요합니다. 이것은 유동세포계측법 분석을 위해 세포를 라벨에도 적용됩니다. 바로 라벨 샘플 유동세포계측법 분석을 실행하지 않는 경우, 샘플은 2 %의 포름 알데히드와 고정하고 나중에 실행할 수 있습니다. 이것은 자동 형광과 희생 샘플의 품질을 높이는 경향이 이후 그러나, 장기 보관하지 않는 것이 좋습니다.
식민지 분리에 대한 중요한 부분은 바로 세포 밀도에서 시딩 (어떤이 실험적으로 최적화한다) 및 기타 클론 둘러싸인되지 않은 단일 클론을 찾는 것입니다. 다른 클론이 근처에있다면, 복제 실린더는 가까운 클론을 비롯한 수 있으며 얻은 세포가 더 이상 하나 복제품에서되지 않습니다. 복제를 통해 복제 실린더를 배치하는 경우, 또한 이것은 세포를 표지 및 그들을 분리하는 세포에 도달에서 트립신을 방지하기 위해 복제 실린더의 하단에있는 실리콘 기름의 원인이 있으므로 접시 표면을 통해 그것을 밀어하지 않도록주의합니다.
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Acknowledgments
작품은 보건 국립 연구소 (R01GM079688, R21RR024439 및 R21GM075838), 국립 과학 재단 (CBET 0,941,055) 및 MSU 재단 일부 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Biotin mouse IgG2a | BD Biosciences | 555572 | |
| Biotin mouse IgG1 | BD Biosciences | 555747 | |
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | |
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | |
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | |
| BD Imag buffer | BD Biosciences | 552362 | |
| Round-bottom tube | BD Biosciences | 352063 | |
| Streptavidin particles | BD Biosciences | 557812 | |
| SA-PE | R&D Systems | F0040 | |
| Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C2059 |
References
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- Abdallah, B. M., Kassem, M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther. 15, 109-116 (2008).
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