Summary
עכברוש MSCs נותקו מן עצמות הירך לבין tibias והעשירו מכן על ידי מיון התא מגנטי. תאים ממוין אושרו עבור ביטוי של סמני פני השטח על ידי cytometry הזרימה. תאים אלה בתרבית גם בצפיפות משובטים כדי ליצור מושבות אחת ואז מושבות אלה היו מופרדים על ידי שכפול צילינדרים.
Abstract
MSCs הם אוכלוסייה של בתאי גזע בוגרים, כי הוא מקור מבטיח עבור יישומים רפואיים. תאים אלה יכולים להיות מבודדים במח העצם ניתן להפריד בקלות מתאי גזע hematopoietic (HSCs) בשל הדבקות הפלסטיק שלהם. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד MSCs עצמות הירך של חולדות tibias. התאים היו מבודדים מועשר נוספת נגד שני סמנים MSCs משטח CD54 ו - CD90 על ידי מיון התא מגנטי. הביטוי של סמנים משטח CD54 ו CD90 אושרו אז על ידי ניתוח cytometry הזרימה. HSC סמן CD45 נכלל גם כדי לבדוק אם MSCs מיון היו מתרוקנים של HSCs. MSCs באופן טבעי הטרוגני למדי. יש subpopulations של תאים בעלי צורות שונות, ריבוי ויכולות בידול. Subpopulations כל אלה מבטאים את סמנים ידועים MSCs ואין סמן ייחודי שטרם זוהו עבור subpopulations שונים. לכן, גישה חלופית להפריד את subpopulations שונים היא באמצעות צילינדרים שיבוט להפריד את התאים שמקורם המושבה יחיד. התאים שמקורם יחיד מושבות אז יכול להיות מתורבת והערכה בנפרד.
Protocol
1. בידוד של עכברוש MSCs
בתאי גזע mesenchymal בודדו 6-8 עכברים בשבוע הישן Sprague-Dawley הנשי כפי שתואר לעיל 1, 2. מבודד MSCs יכול לדבוק משטח פלסטיק להרחיב בקלות במהלך בתרבות חוץ גופית.
- החיה הוכנס לחדר הרדמה מורדם במשך כחמש דקות. במהלך ההרדמה, לבחון את קצב הנשימה, ממצמצת ופעילות מוטורית. הסר את החיה מהאולם מיד אחרי זה מפסיק פעילות מוטורית ושיעור מהבהב והלכו.
- הנח את חיה על תחנת פעולה להרוג את בעל החיים על ידי נקע בצוואר הרחם. חותכים את עצמות הירך לבין tibias מן הגפיים בחזרה, להסיר את העור והשרירים.
- שים את עצמות הירך גזור tibias ו ב 70% isopropanol במשך כמה שניות ומעבירים 1X D-PBS.
- בארון biosafety, עצמות הירך ושל tibias הועברו צלחת 10 ס"מ המכיל DMEM. כל עצם התקיים אז עם פינצטה את שני הקצוות נחתכו לפתוח עם מספריים. צרף מחט 22g כדי מזרק 3ml ולמלא אותו DMEM, ולאחר מכן לשטוף את מוח לשפופרת 50 מ"ל על ידי החדרת מחט בקצה אחד פתוח של העצם. חזור על 2 ~ 3 פעמים עבור כל עצם. כאשר כל הדלועים התקבלו, resuspend התאים ולהעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70μm להסיר את פסולת עצם אגרגטים דם.
- ספין למטה תאים ב 200 גרם, 4 ° C למשך 5 דקות ולהסיר את supernatant על ידי שאיפה. תאים Resuspend במדיום MSC 25ml (DMEM המכיל 10% FBS ו -1% עט סטרפטוקוקוס). ההשעיה 10ml התא היה seeded לתוך צלחת 10 ס"מ כל תרבות עבור סכום כולל של שתי מנות. שמור את הכלים תרבות 37 ° C ו 5% CO 2 חממה 1 ~ 2 שבועות. בינוני שונתה כל 2 ~ 3 ימים.
2. העשרה של עכברוש MSCs
מספר חלבונים השטח שימשו להעשיר MSCs, כולל CD54, CD90, CD73, CD105 CD271 ו 3-5. במחקר, השתמשנו CD54 ו CD90 כסמנים להעשיר MSCs ידי מיון התא מגנטי.
- כאשר תאים הגיע סביב 80% confluency, לשאוב הבינוני להוסיף 4 ~ 5 מ"ל טריפסין-EDTA על כל מנה. שים את הכלים בחזרה החממה דגירה כ 5 דקות, כדי לאפשר ניתוק התא. לאחר התאים היו מנותקים, להוסיף כמות שווה של המדיום תרבות להשבית טריפסין. איסוף ההשעיה התא לתוך שפופרת 15 מ"ל ותאי ספין למטה על 200 גרם, 4 ° C למשך 5 דקות.
- השלבים הבאים מתארים כיצד להעשיר MSCs על ידי שני סמנים משטח CD54 ו - CD90 על פי המדריך להפרדת תאים באמצעות BD IMagnet. תא גלולה היה resuspended במאגר תא מכתים (FBS חום 3% מומת ב 1X D-PBS) ב 20 מיליון תאים / מ"ל. נוגדן Biotinylated CD54 (0.25μg למיליון תאים) ו נוגדן biotinylated CD90 (0.15μg למיליון תאים) נוספה מעורב בעדינות עם ההשעיה התא. לאחר דגירה על קרח במשך 15 דקות, תאים שכותרתו נשטפו עם נפח עודף של חיץ 1X מתאר לעצמי BD. התאים היו שכותרתו הסתובב לעבר 200 גרם, 4 ° C למשך 5 דקות.
- וורטקס מתאר לעצמי BD חלקיקים streptavidin ביסודיות, להוסיף חלקיקים 40μl לכל 10 מיליון תאים. מערבבים את החלקיקים עם תאים שכותרתו ביסודיות דגירה התאים ב 6 ~ 12 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. זה מאפשר את חלקיקי streptavidin כדי לאגד את biotinylated אנטי CD54 אנטי CD90, אשר חייב את החלבונים פני השטח CD54 ו CD90 בהתאמה.
- בזמן הדגירה, תווית צינור עגול התחתונה מבחן כדי לאסוף את חלק חיובי. לאחר דגירה, להביא את נפח תיוג עד 20 מיליון תאים / מ"ל עם חיץ 1X מתאר לעצמי BD ולהעביר את התאים שכותרתו צינור חלק חיובי את האוסף. המקום צינור חלק חיובי אל IMagnet BD ולתת לו להישאר במשך 6 דקות, ואז להסיר את supernatant עם פיפטה פסטר זכוכית עם צינור חלק חיובי עדיין IMagnet את BD.
- הסר את הצינור חיובי חלק מן IMagnet BD ולמקם אותו על הקרח. הוסף 1ml קרים 1X BD מתאר לעצמי חיץ ותאי resuspend ידי ערבוב עדין. מניחים את הצינור בחזרה אל IMagnet BD ולתת לו להישאר 2 ~ 4 דקות. הסר את supernatant חדש עם זכוכית פיפטה פסטר. חזור הכביסה כפי שתואר פעם אחת 2.5 יותר.
- הוצא את הצינור מתוך IMagnet BD ותאי resuspend במדיום תרבות, זרע one 75 ס"מ 2 בקבוק לשמירה על תאים צלחת 10 ס"מ עבור cytometry הזרימה.
3. אימות הביטוי מרקר Surface על ידי זרימת cytometry
Cytometry ניתוח תזרים בוצעה לאמת את התאים השגנו לבטא CD54 ו - CD90. סמן CD45 HSC שימש כדי לוודא MSCs היו מתרוקנים של HSCs.
- כאשר תאים הופכים ומחוברות ~ 80%, trypsinize תאים עם טריפסין-EDTA לאסוף תאים לתוך שפופרת 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 200 גרם, 4 ° C למשך 5 דקות כדי לאסוף את התאים.
- לשאוב supernatant והיהh תאים עם 1X D-PBS פעם. תאים Resuspend במאגר מכתים תאים (1X D-PBS המכיל 2% FBS ו אזיד הנתרן 0.05%) לריכוז סופי של 5 ~ 10 מיליון תאים / מ"ל ולשמור תאים על הקרח. 100μl Aliquot תא ההשעיה תוך שישה צינורות שכותרתו (1 תאים בלבד. 2 אלוטיפ לשלוט IgG2a:.. 3 שליטת אלוטיפ IgG1; 4 CD45; 5. CD54,.. 6 CD90).
- הוספת פקדי אלוטיפ ונוגדנים העיקרי בריכוזים המתאים (IgG2a ו IgG1: 20μl למיליון תאים; CD45: 0.5μg למיליון תאים; CD54: 0.25μg למיליון תאים; CD90: 0.15μg למיליון תאים) ו דגירה על 4 מעלות 30 דקות.
- שטפו תאים עם 1X D-PBS פעמיים ואז התאים resuspend במאגר תא 100μl מכתים. הוסף SA-PE (streptavidin-phycoerythrin, להשתמש 0.15μg למיליון תאים) ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.
- שטפו תאים שכותרתו עם 1X D-PBS פעמיים. Resuspend תאים חיץ תא 400μl מכתים והעברת צינור בז לניתוח cytometry הזרימה.
4. ההפרדה של המושבה, סינגל נגזר MSCs
MSCs אוכלוסייה הטרוגנית המורכבת subpopulations שונים עם צורה תאים שונים, קצב הצמיחה, כמו גם יכולת הבחנה 6. עם זאת, כל subpopulations מבטאים סמנים MSC ידוע ולכן הוא לא ריאלי להשתמש סמנים להפריד את אלה subpopulations. לכן, אנחנו מוחלים צילינדרים שיבוט להפריד את subpopulations שונים, אשר הוקמה על ידי מושבות תאים בודדים.
- פלייט תאים בערך 50 ~ 100 תאים לכל צלחת 10 ס"מ. דגירה של 37 ° C ו 5% CO 2 חממה 1 ~ 2 שבועות. במהלך תקופה זו, לבחון מושבות מבודדות היטב עם מיקרוסקופ הפוכה. לאחר המושבות הגיעו לגודל מספיק גדול (טוב יותר מ 100 תאים במושבה כל אחת), לסמן את מושבות עם לנוכל בתחתית המנה. מתי לקחת את המושבה להיות מסומן, לוודא שאין סביב מושבות ליד אחד הרים.
- לשאוב בינוני לשטוף את צלחת אחת עם 1X D-PBS. תרימי גליל שיבוט סטרילי עם מלקחיים סטריליות ומניחים בעדינות אותו סביב המושבה המסומן. חזור על פעולה זו עד שכל המושבות מסומן יש להציב מעל גליל שיבוט. מושבות הרים צריך להיות רחוק כל כך אחרת, שכל צילינדר שיבוט רק מכיל המושבה.
- הוסף 100μl טריפסין-EDTA על גליל כל שיבוט ולשים את המנה חזרה חממה ~ 5 דקות. אחרי 5 דקות, לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לראות אם הם עיגול למעלה. כאשר תאים יש הרים, מוסיפים כמות שווה של המדיום תרבות להשבית טריפסין. מערבבים את ההשעיה תא עם micropipettor 200μl ולהעביר את ההשעיה התא לצלחת 60mm המכיל 3ml בינוני תרבות prewarmed. לייבל את הכלים שצריך לשים אותם בחזרה לתוך החממה. מעקב אחר שינוי מורפולוגי במהלך הימים הקרובים.
5. נציג תוצאות
על פי הפרוטוקול המתואר בחלק לבידוד MSCs חולדה, MSCs חסיד פלסטיק צריך להיות גלוי למחרת לאחר ציפוי. כאשר התאים ממשיכים להתרבות, התאים ומחוברות צריך להיראות כמו תאים שמוצג באיור 1 א. כאשר תאים להגיע confluency ~ 80% (איור 1B), subculturing יכול להתבצע. במהלך תת, טריפסין-EDTA שימש לנתק תאים תאים הרים קטנים ועגולים, כפי שמוצג באיור 1C.
באיור 1. בניגוד לשלב תמונות של עכברוש MSCs. (א) ומחוברות MSCs. רוב התאים הם ציר דמוי כוכב או דמוי. (ב) MSCs סביב 80% confluency. (ג) תאים הרים לאחר trypsinization קטנים ועגולים.
לאחר MSCs מועשרים ידי מיון התא מגנטי, cytometry ניתוח תזרים מבוצע כדי לאמת את הסמן הבעות פני השטח. אם העשרה הוא טוב, התאים צריכים להראות מכתים חיובי נגד סמנים MSC CD54 ו CD90 אבל שלילי נגד סמן CD45 HSC (איור 2). אלוטיפ שולטת IgG2a ו IgG1 משמשים שולטת שלילית.
איור 2. Cytometry זרימה ניתוח MSCs עבור סמנים פני השטח. MSCs תויגו עם נוגדנים נגד IgG2a (אלוטיפ בקרה 1), IgG1 (אלוטיפ בקרה 2), CD45, CD54 ו - CD90. MSCs ביטוי CD54 ו CD90 אבל לא CD45.
כאשר התאים זורעים בצפיפות המשובטים ראויה, מושבות צריך לעלות מ תאים בודדים. איור 3A מייצג המושבה שהוקמה על ידי תא בודד. שכפול צילינדרים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להפריד בין מושבות תאים שמקורם במושבות יכול להיות מתורבת בנפרד. איור 3B ו - 3C מייצג בתאים שמקורם שתי המושבות בודדים. בתאים שמקורם המושבה 1 הם כמו כישור (איור 3B) ואילו בתאים שמקורם המושבה 2 עגולים (איור 3 ג).
איור 3. הקמת מושבה על ידי MSCs תאים שמקורם מושבת יחיד. MSCs תרבותי על המשובטים טופס צפיפות מושבות בודדות. מושבות אלה יכולים להיות מופרדים על ידי צילינדרים שיבוט ותאי ממושבות שונות יכול להיות מתורבת בנפרד. (א) נציג המושבה שהוקמה על ידי MSCs כאשר מצופה בצפיפות משובט. (ב) Spindle כמו בתאים שמקורם מושבה אחת. (ג) תאים עגולים נגזר מושבה אחרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד ולהעשיר MSCs. שיטה להפריד את המושבה חד תאים שמקורם היא גם Incorporated. ישנם כמה צעדים חשובים עבור הפרדה, בידוד העשרה המושבה מוצלח. אמנם עושה את תא הבידוד מן החולדה, מומלץ לסנן דרך מסננת או תא רשת ניילון סטריליים בגודל דומה להיפטר של קרישי דם ושברים בעצמות. לאחר ציפוי התאים לילה, תאים מתים רבים יהיה צף בינוני לבין תאים מתים יוסרו על ידי החלפת בינוני עם טרי שאמור לעזור את הצמיחה של תאים המצורפת.
התא מגנטי ומיון פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע סלקציה חיובית, נהלים דומים ניתן להשתמש כדי לבצע סלקציה שלילית. כמות הנוגדנים שיתווספו עשוי להשתנות ואופטימיזציה נדרש כדי להשיג מיון טוב יותר. הדבר נכון גם עבור תיוג התאים לניתוח cytometry הזרימה. אם לא פועל cytometry ניתוח תזרים עבור דגימות מתויג מיד, דגימות יכול להיות קבוע עם פורמלדהיד 2% ולהפעיל מאוחר יותר. עם זאת, אחסון לטווח ארוך אינו מומלץ כיוון זה נוטה להגדיל את פלואורסצנציה אוטומטי מדגם איכות הקרבה.
חלק מרכזי להפרדה המושבה היא זריעת בצפיפות התא הימני (שאמור להיות מותאם באופן ניסיוני) ואיתור שיבוטים אחד שלא מוקפים שיבוטים אחרים. אם יש שיבוטים אחרים בקרבת מקום, גליל השיבוט עשוי להקיף את שיבוטים סמוך התאים המתקבלים כבר לא יהיה מן לשבט אחד. כאשר הנחת גליל שיבוט על שיבוט, גם להיזהר שלא להחליק אותו על פני צלחת כמו זו תגרום גריז סיליקון בחלק התחתון של הגליל שיבוט כדי לכסות את התאים ולמנוע טריפסין מלהגיע תאים לנתק אותם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
העבודה נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לבריאות (R01GM079688, R21RR024439 ו R21GM075838), הקרן הלאומית למדע (CBET 0941055), וקרן MSU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Biotin mouse IgG2a | BD Biosciences | 555572 | |
| Biotin mouse IgG1 | BD Biosciences | 555747 | |
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | |
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | |
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | |
| BD Imag buffer | BD Biosciences | 552362 | |
| Round-bottom tube | BD Biosciences | 352063 | |
| Streptavidin particles | BD Biosciences | 557812 | |
| SA-PE | R&D Systems | F0040 | |
| Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C2059 |
References
- de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells. J Neurochem. 91, 155-166 (2004).
- Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells. J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Kassem, M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther. 15, 109-116 (2008).
- Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. Krause Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 102, 3483-3493 (2003).
- Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).
