Summary
وكانت الفئران المعزولة من اللجان الدائمة وfemurs tibias وإثراء ثم فرز الخلايا المغناطيسية. وتأكدت الخلايا فرز للتعبير عن السطح علامات التدفق الخلوي. وكانت أيضا هذه الخلايا المستزرعة في كثافة نسيلي لتشكيل المستعمرات واحدة ثم تم فصل هذه المستعمرات التي اسطوانات الاستنساخ.
Abstract
اللجان الدائمة هي مجموعة من الخلايا الجذعية البالغة التي هي مصدر واعد للتطبيقات علاجية. يمكن عزل هذه الخلايا من نخاع العظم ويمكن فصلها بسهولة من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) بسبب تمسكهم البلاستيك. هذا البروتوكول يصف كيفية عزل من اللجان الدائمة وtibias femurs الفئران. وإثراء للخلايا معزولة ضد اثنين من علامات سطح اللجان الدائمة CD54 CD90 والفرز من قبل خلية المغناطيسي. ثم تأكدت من علامات التعبير والسطحية CD54 CD90 عن طريق تحليل التدفق الخلوي. كما تم تضمين علامة HSC CD45 للتحقق مما إذا كانت اللجان الدائمة استنزاف فرزها من HSCs. اللجان الدائمة هي بطبيعة الحال غير متجانسة تماما. هناك مجموعات سكانية فرعية من الخلايا التي تحتوي على أشكال مختلفة ، وقدرات الانتشار التمايز. هذه المجموعات السكانية الفرعية تعبر عن جميع اللجان الدائمة وعلامات معروفة لم تكن هناك علامة فريدة لتحديد الشرائح السكانية المختلفة. لذلك ، نهجا بديلا لفصل المجموعات السكانية الفرعية المختلفة باستخدام اسطوانات استنساخ لفصل واحد مستعمرة الخلايا المشتقة. ويمكن عندئذ الخلايا المشتقة من المستعمرات واحد يكون مثقف وتقييمها بشكل منفصل.
Protocol
1. بمعزل عن اللجان الدائمة الجرذ
تم عزل الخلايا الجذعية الوسيطة 6-8 الاسبوع الفئران سبراغ داولي الإناث القديمة كما هو موضح سابقا 1 و 2. يمكن عزل اللجان الدائمة التمسك سطح البلاستيك وتوسيع بسهولة في المختبر خلال الثقافة.
- وضعت الحيوان الى غرفة التخدير والخدر لنحو خمس دقائق. أثناء التخدير ، ومراقبة معدل التنفس ، وامض والنشاط الحركي. إزالة الحيوان من الغرفة على الفور بعد أن توقف عن النشاط الحركي ومعدل وامض أصبحت نادرة.
- وضع الحيوانات الخناق على محطة التشغيل وقتل الحيوان خلع عنق الرحم. قطع femurs وtibias من أطرافهم مرة أخرى ، إزالة الجلد والعضلات.
- وضع femurs تشريح وtibias في 70 ٪ الأيزوبروبانول لبضع ثوان ، ونقل إلى D - 1X PBS.
- في خزانة السلامة الأحيائية ، ونقلت وfemurs tibias إلى صحن يحتوي على DMEM 10cm. وعقدت بعد ذلك كل عظم مع ملاقط وخفضت طرفي مفتوحة مع مقص. إرفاق الإبرة إلى حقنة 22G 3ml وملء مع DMEM ، ثم طرد النخاع في أنبوب 50ml بإدخال إبرة إلى نهاية واحدة مفتوحة من العظام. كرر 2 ~ 3 مرات لكل العظام. عندما تم الحصول على جميع الكوسا ، resuspend الخلايا وتمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 70μm لازالة الانقاض والركام العظم الدم.
- تدور باستمرار في الخلايا 200G ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وإزالة طاف بواسطة الطموح. Resuspend الخلايا في المتوسط MSC 25ml (DMEM تحتوي على 10 ٪ و 1 ٪ FBS القلم بكتيريا). وكان المصنف 10ML تعليق خلية في كل ثقافة 10cm طبق لما مجموعه اثنين من الأطباق. الحفاظ على ثقافة الأطباق في 37 درجة مئوية و 5 ٪ للثاني حاضنة 2 1 2 أسابيع ~. تم تغيير كل المتوسطة 2 ~ 3 أيام.
2. إثراء اللجان الدائمة الجرذ
وقد تم استخدام عدد من البروتينات السطحية لتخصيب اللجان الدائمة ، بما في ذلك CD54 ، CD90 ، CD105 ، CD271 CD73 و 3-5. في دراستنا ، واستخدمنا CD54 CD90 كعلامات لتخصيب اللجان الدائمة عن طريق الفرز الخلية المغناطيسي.
- عندما وصلت الخلايا نحو 80 ٪ confluency ، نضح على المديين المتوسط وإضافة 4 ~ 5ml التربسين - EDTA لكل طبق. وضع الأطباق العودة إلى الحاضنة واحتضان لحوالي 5 دقائق للسماح للمفرزة الخلية. مرة واحدة وفصل الخلايا ، إضافة كمية متساوية من مستنبت لتعطيل التربسين. جمع التعليق الخلية في أنبوب 15ml وخلايا تدور في اسفل 200G ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
- الخطوات التالية تصف كيفية تخصيب اللجان الدائمة بواسطة علامات سطح ثنائي CD54 CD90 وفقا لدليل لفصل الخلايا باستخدام IMagnet دينار بحريني. وكان بيليه معلق الخلية في الخلية تلطيخ العازلة (3 ٪ FBS الحرارة المعطل في D - 1X PBS) بمبلغ 20 مليون خلية / مل. وأضاف Biotinylated CD54 الأجسام المضادة (0.25μg لكل مليون الخلايا) وbiotinylated CD90 الأجسام المضادة (0.15μg لكل مليون الخلايا) والمختلط بلطف مع التعليق الخلية. بعد الحضانة على الجليد لمدة 15 دقيقة ، تم غسلها الخلايا المسمى مع وحدة تخزين فائض العازلة 1X ايماج دينار بحريني. كانت تغزل الخلايا المسمى في اسفل 200G ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
- دوامة من الجسيمات ايماج دينار بحريني streptavidin بدقة ، إضافة جزيئات الخلايا 40μl لكل 10 ملايين نسمة. مزيج من الجسيمات مع الخلايا المسماة بدقة واحتضان الخلايا في 6 ~ 12 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. هذا يسمح للجزيئات streptavidin ربط biotinylated مكافحة CD54 CD90 والمعادية ، والتي لا بد أن البروتينات السطحية CD54 CD90 وعلى التوالي.
- خلال فترة الحضانة ، والتسمية أنبوب اختبار الجولة القاع لجمع جزء إيجابية. بعد مرور فترة الحضانة ، وتحقيق حجم العلامات إلى 20 مليون خلية / مل مع العازلة 1X ايماج دينار بحريني ونقل الخلايا المسمى إلى أنبوب جمع إيجابية الكسر. مكان الكسر إيجابية على أنبوب للIMagnet دينار بحريني ، والسماح لها بالبقاء لمدة 6 دقائق ، ثم إزالة طاف مع ماصة باستير أنبوب زجاجي مع الكسر لا تزال إيجابية على IMagnet دينار بحريني.
- إزالة جزء أنبوب إيجابية من IMagnet دينار بحريني ووضعه على الجليد. إضافة 1ml الجليد الباردة 1X العازلة ايماج دينار بحريني والخلايا resuspend عن طريق خلط لطيف. وضع أنبوب ليعيدوه الى IMagnet دينار بحريني ، والسماح لها بالبقاء لمدة 2 دقيقة 4 ~. إزالة طاف مع ماصة جديدة باستور الزجاج. تكرار الغسيل كما هو موضح في وقت واحد أكثر من 2.5.
- إزالة أنبوب من IMagnet دينار بحريني والخلايا resuspend في مستنبت ، والبذور one 75cm 2 قارورة للحفاظ على الخلايا وطبق 10cm عن التدفق الخلوي.
3. التحقق من التعبير ماركر السطحية بواسطة التدفق الخلوي
أجري تحليل تدفق الخلوي للتحقق من الخلايا التي حصلنا عليها والتعبير عن CD54 CD90. تم استخدام HSC CD45 علامة لتأكيد أنه تم استنفاد اللجان الدائمة للHSCs.
- عندما تصبح الخلايا ~ متموجة 80 ٪ ، يعرض للتريبسين الخلايا مع التربسين - EDTA وجمع الخلايا في أنبوب 15ml. الطرد المركزي في 4 ، 200G درجة مئوية لمدة 5 دقائق لجمع الخلايا.
- نضح في وطافح مع الخلايا D - 1X PBS مرة واحدة. Resuspend الخلايا في خلية تلوين العازلة (D - 1X PBS التي تحتوي على 2 ٪ و 0.05 ٪ FBS أزيد الصوديوم) إلى التركيز النهائي من 5 ~ 10 مليون خلية / مل والحفاظ على الخلايا على الجليد. تعليق قسامة الخلية 100μl في أنابيب six المسمى (1 الخلايا فقط ؛ 2 isotype السيطرة IgG2a ؛ السيطرة Isotype 3 IgG1 ؛ CD45 4 و 5 CD54 ؛. CD90 6).
- إضافة عناصر تحكم isotype والأجسام المضادة الأولية بتركيزات مناسبة (IgG2a وIgG1 : 20μl لكل مليون خلايا ؛ CD45 : 0.5μg لكل مليون خلايا ؛ CD54 : 0.25μg لكل مليون خلايا ؛ CD90 : 0.15μg لكل مليون خلايا) ، واحتضان عند درجة 4 ل 30 دقيقة.
- غسل الخلايا مع D - 1X PBS مرتين ثم resuspend الخلايا في خلية 100μl العازلة تلطيخ. إضافة SA - PE (streptavidin - فيكوإيريترين ، واستخدام الخلايا 0.15μg لكل مليون) ، واحتضان عند 4 لمدة 30 دقيقة في الظلام درجة مئوية.
- غسل الخلايا المسمى مع D - 1X PBS مرتين. Resuspend الخلايا في خلية 400μl تلطيخ العازلة ونقل إلى أنبوب الصقر للتحليل التدفق الخلوي.
4. الفصل بين مستعمرة واحدة مشتقة اللجان الدائمة
اللجان الدائمة هي مجموعة من السكان غير متجانسة مؤلفة من مجموعات سكانية فرعية مختلفة مع الشكل مختلفة من الخلايا ، ومعدل النمو ، فضلا عن القدرة على التفريق 6. ومع ذلك ، فإن جميع الشرائح السكانية تعبر عن العلامات المعروفة MSC وبالتالي فإنه ليس من المجدي استخدام علامات لفصل خارج هذه المجموعات السكانية الفرعية. لذلك ، طبقنا اسطوانات استنساخ لفصل المجموعات السكانية الفرعية المختلفة ، والتي هي مستعمرات الخلايا التي شكلتها واحد.
- لوحة الخلايا بنحو 50 خلية لكل 100 ~ 10cm الطبق. احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 الحاضنة لمدة 1 2 أسابيع ~. خلال هذه الفترة ، ودراسة مستعمرات معزولة بشكل جيد مع مجهر مقلوب. بمجرد أن وصلت إلى حجم مستعمرات كبيرة بما يكفي (أكثر من 100 أفضل الخلايا في كل مستعمرة) ، وعلامة على المستعمرات مع sharpie في قاع الطبق. عند اختيار مستعمرة لتكون وضعت ، تأكد من عدم وجود المستعمرات المحيطة واحدة التقطت قرب.
- نضح المتوسطة ويغسل مرة واحدة مع طبق D - 1X PBS. التقط اسطوانة الاستنساخ العقيمة مع ملقط معقم ووضعه برفق حول مستعمرة ملحوظ. كرر هذا حتى جميع المستعمرات وضعت اسطوانة الاستنساخ وضعها فوق. ينبغي للمستعمرات التقطت تكون بعيدة عن كل تلك الأخرى التي تحتوي كل اسطوانة الاستنساخ واحدة فقط مستعمرة.
- إضافة 100μl التربسين - EDTA لكل اسطوانة الاستنساخ ووضع الطبق إلى حاضنة لمدة 5 دقائق ~. بعد 5 دقائق ، والتحقق من الخلايا تحت المجهر لمعرفة ما إذا كانت تصل التقريب. عندما تصل الخلايا رفعت ، إضافة كمية متساوية من مستنبت لتعطيل التربسين. مزيج تعليق خلية مع micropipettor 200μl ونقل التعليق الخلية التي تحتوي على طبق 60mm 3ml مستنبت prewarmed. صحيح تسمية الأطباق ووضعها من جديد في الحاضنة. تعقب التغييرات الشكلية على مدى الأيام القليلة القادمة.
5. ممثل النتائج
وفقا للبروتوكول وصفها في الجزء اللجان الدائمة للعزلة الفئران ، وينبغي أن اللجان الدائمة ملتصقة البلاستيك تكون مرئية في اليوم التالي بعد الطلاء. كما الخلايا تستمر في الانتشار ، ينبغي أن تبدو وكأنها خلايا متكدسة الخلايا هو موضح في الشكل 1A. عندما تصل الخلايا ~ 80 ٪ confluency (1B الشكل) ، ويمكن أن يتم خارج subculturing. خلال ثقافة فرعية ، استخدمت التربسين - EDTA لفصل الخلايا والخلايا رفع صغيرة ومستديرة كما هو مبين في الشكل 1C.
الشكل 1. على النقيض من الصور مرحلة من اللجان الدائمة الفئران. (A) مندمج MSCS. غالبية الخلايا المغزل مثل نجمة أو مثل. (ب) اللجان الدائمة حوالي 80 ٪ confluency. (C) ورفعت بعد trypsinization خلايا صغيرة ومستديرة.
حالما يتم التخصيب اللجان الدائمة عن طريق الفرز الخلية المغناطيسي ، يتم تنفيذ تحليل تدفق الخلوي للتحقق من التعبيرات علامة السطح. إذا تخصيب جيدة ، يجب أن تظهر خلايا تلطيخ إيجابية في مكافحة علامات MSC CD54 CD90 ولكن السلبية ضد علامة HSC CD45 (الشكل 2). وتستخدم عناصر التحكم Isotype IgG2a وIgG1 والضوابط سلبية.
الشكل 2. وصفت تحليل التدفق الخلوي من اللجان الدائمة للعلامات السطح. اللجان الدائمة مع أجسام مضادة ضد IgG2a (isotype الرقابة 1) ، IgG1 (isotype التحكم 2) ، CD45 ، CD54 CD90 و. وأعربت اللجان الدائمة وCD54 CD90 CD45 ولكن لا.
عندما تكون خلايا المصنف في كثافة نسيلي الصحيح ، وينبغي أن يرتفع من مستعمرات الخلايا واحد. 3A الرقم يمثل مستعمرة شكلتها خلية واحدة. ويمكن عندئذ أن تستخدم اسطوانات استنساخ لفصل ويمكن تربيتها في المستعمرات والخلايا المشتقة من المستعمرات بشكل منفصل. والرقم 3B 3C تمثل الخلايا المشتقة من اثنين من المستعمرات الفردية. الخلايا المشتقة من مستعمرة 1 هي مثل مغزل (الشكل 3B) في حين أن الخلايا المشتقة من مستعمرة 2 مستديرة الشكل (3C).
الشكل 3. تشكيل اللجان الدائمة ومستعمرة من قبل احد مستعمرة الخلايا المشتقة. اللجان الدائمة مثقف في نسيلي كثافة المستعمرات الفردية النموذج. ويمكن فصل هذه المستعمرات التي اسطوانات الاستنساخ والخلايا من مستعمرات مختلفة يمكن تربيتها بشكل منفصل. (أ) مستعمرة ممثل شكلتها اللجان الدائمة عندما مطلي في كثافة نسيلي. (ب) المغزل مثل الخلايا المشتقة من مستعمرة. (C) مشتقة من خلايا جولة أخرى مستعمرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول يصف كيفية عزل وإثراء MSCS. وهو مدرج أيضا طريقة لفصل الخلايا مستعمرة واحدة مشتقة. هناك العديد من الخطوات التي تعتبر مهمة للفصل العزلة ، والإثراء ، ومستعمرة ناجحة. أثناء القيام العزلة خلية من الفئران ، فمن المستحسن لتصفية من خلال مصفاة خلية أو شبكة النايلون العقيمة مشابهة من حيث الحجم للتخلص من جلطات الدم والحطام العظام. بعد طلاء الخلايا بين عشية وضحاها ، وسوف يكون العديد من الخلايا الميتة طافية في الأجلين المتوسط وتتم إزالة الخلايا الميتة عن طريق استبدال الطازجة مع المتوسط الذي ينبغي أن يساعد على نمو الخلايا المرفقة.
الخلية الفرز المغناطيسي في هذا البروتوكول توضح كيفية تنفيذ مجموعة إيجابية ، ويمكن استخدام إجراءات مماثلة لإجراء الاختيار السلبي. قد يكون مقدار من الأجسام المضادة التي يمكن ان تضاف وتختلف مطلوب الأمثل لتحقيق أفضل الفرز. هذا ينطبق أيضا على وضع العلامات الخلايا لتحليل التدفق الخلوي. إذا لم يكن قيد التشغيل التدفق الخلوي تحليل لعينات المسمى على الفور ، ويمكن ان تكون ثابتة مع عينات الفورمالديهايد 2 ٪ وتشغيل في وقت لاحق. ومع ذلك ، فمن غير المستحسن تخزين طويل الأجل لأن هذا يميل إلى زيادة السيارات ومضان والتضحية نوعية العينة.
الجزء الرئيسي لفصل المستعمرة هو بذر في كثافة الخلية اليمنى (يجب أن يكون الأمثل الذي تجريبيا) ، وتحديد مكان واحد الحيوانات المستنسخة التي لا تحيط بها الحيوانات المستنسخة الأخرى. إذا كان هناك استنساخ أخرى قريبة ، قد تشمل الاسطوانة استنساخ استنساخ الخلايا المجاورة والتي تم الحصول عليها لن يكون من استنساخ. عند وضع اسطوانة الاستنساخ على استنساخ ، يمكن أيضا أن تحرص على عدم الانزلاق فوق سطح الطبق حيث أن هذا سيتسبب السيليكون الشحوم في الجزء السفلي من الاسطوانة لتغطية استنساخ الخلايا ومنع التربسين من الوصول إلى الخلايا لفصل منها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد العمل في جزء من المعهد الوطني للصحة (R01GM079688 ، R21RR024439 وR21GM075838) ، المؤسسة الوطنية للعلوم (CBET 0941055) ، ومؤسسة جامعة ولاية ميشيغان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Biotin mouse IgG2a | BD Biosciences | 555572 | |
| Biotin mouse IgG1 | BD Biosciences | 555747 | |
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | |
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | |
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | |
| BD Imag buffer | BD Biosciences | 552362 | |
| Round-bottom tube | BD Biosciences | 352063 | |
| Streptavidin particles | BD Biosciences | 557812 | |
| SA-PE | R&D Systems | F0040 | |
| Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C2059 |
References
- de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells. J Neurochem. 91, 155-166 (2004).
- Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells. J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Kassem, M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther. 15, 109-116 (2008).
- Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. Krause Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 102, 3483-3493 (2003).
- Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).
