Summary
Rata MSC fueron aisladas de fémur y la tibia y luego enriquecido por la clasificación de células magnéticas. Células seleccionadas fueron confirmados para la expresión de marcadores de superficie por citometría de flujo. Estas células fueron cultivadas a una densidad de clones para formar colonias aisladas y luego estas colonias fueron separados por cilindros de clonación.
Abstract
MSC son una población de células madre adultas, que es una fuente prometedora para aplicaciones terapéuticas. Estas células pueden ser aisladas de la médula ósea y pueden separarse fácilmente de las células madre hematopoyéticas (HSC), debido a su adhesión de plástico. Este protocolo describe cómo aislar las MSC del fémur y la tibia de ratas. Las células aisladas se enriquecieron aún más en contra de dos marcadores de superficie CD54 y CD90 MSC por la clasificación de células magnéticas. Expresión de marcadores de superficie CD54 y CD90 fueron luego confirmadas por análisis de citometría de flujo. HSC marcador CD45 también se incluyó para comprobar si los ordenados MSC se agotaron las CMH. MSC son, naturalmente, muy heterogéneos. Hay subpoblaciones de células que tienen diferentes formas, la proliferación y diferenciación de las capacidades. Estas subpoblaciones todos expresan el conocido marcadores de CMM y ningún marcador único ha sido identificado por las distintas subpoblaciones. Por lo tanto, un enfoque alternativo para separar las distintas subpoblaciones está utilizando cilindros de clonación para separar de una sola colonia de células derivadas. Las células derivadas de las colonias solo se puede cultivar y evaluar por separado.
Protocol
1. El aislamiento de MSC Rata
Las células madre mesenquimales fueron aisladas de 6-8 semanas de edad Sprague-Dawley hembra de rata como se describió anteriormente 1, 2. MSC aisladas pueden adherirse a la superficie de plástico y fácilmente se expanden durante el cultivo in vitro.
- El animal se puso en una cámara de anestesia y anestesiado durante unos cinco minutos. Durante la anestesia, observar el ritmo de la respiración intermitente, y la actividad motora. Quitar el animal de la cámara inmediatamente después de que se detenga la actividad motora y la tasa de parpadeo se convirtió en poco frecuentes.
- Coloque al animal en una estación de operación y matar al animal por dislocación cervical. Corte el fémur y la tibia de las extremidades hacia atrás, quitar la piel y los músculos.
- Ponga los fémures y tibias disecados en el 70% de isopropanol durante unos segundos y la transferencia a D-PBS 1X.
- En un gabinete de bioseguridad, el fémur y la tibia se transfirió a una placa de 10 cm que contiene DMEM. Cada hueso se llevó a cabo luego con las pinzas y los dos extremos se abrieron con una tijera. Coloque una aguja 22G a una jeringa de 3 ml y llenarlo con DMEM, luego vaciar la médula ósea en un tubo de 50 ml mediante la inserción de la aguja en un extremo abierto de los huesos. Repita 2 a 3 veces por cada hueso. Cuando todas las calabazas se han obtenido, resuspender las células y pasar la suspensión de células a través de un filtro de 70μm de células para eliminar los restos de los huesos y los agregados de la sangre.
- Centrifugar las células a 200 g, 4 ° C durante 5 minutos y retirar el sobrenadante por aspiración. Resuspender las células en 25 ml de medio MSC (DMEM con 10% de SFB y 1% de Pen-estreptocócica). 10 ml de suspensión celular se sembró en cada plato de cultivo de 10 cm para un total de dos platos. Mantener las placas de cultivo en un 37 ° C y 5% de CO 2 incubadora de 1 a 2 semanas. Medio se cambió cada 2 o 3 días.
2. Enriquecimiento de MSC Rata
Una serie de proteínas de superficie se han utilizado para enriquecer MSC, incluyendo CD54, CD90, CD73, CD105 y CD271 3-5. En nuestro estudio, hemos utilizado CD54 y CD90 como marcadores para enriquecer las MSC de clasificación de células magnéticas.
- Cuando las células alcanzaron alrededor del 80% de confluencia, se aspira el medio y añadir 4 ~ 5 ml de tripsina-EDTA a cada plato. Ponga los platos de nuevo a la incubadora y se incuba durante unos 5 minutos para permitir que el desprendimiento de células. Una vez que las células fueron separadas, añadir la misma cantidad de medio de cultivo para inactivar la tripsina. Recoger la suspensión de células en un tubo de 15 ml y las células de girar en 200 g, 4 ° C durante 5 minutos.
- Los pasos siguientes describen cómo enriquecer MSC por dos marcadores de superficie CD54 y CD90 de acuerdo con el manual para la separación celular mediante BD IMagnet. Pellet de células se resuspendieron en tampón de tinción de células (3% de SFB inactivado por calor en 1X D-PBS) a 20 millones de células / ml. Biotinilado CD54 anticuerpos (0.25μg por millón de células) y biotina CD90 anticuerpos (0.15μg por millón de células) y se mezcla suavemente con la suspensión celular. Después de la incubación en hielo durante 15 minutos, se lavaron las células marcadas con un exceso de volumen de buffer 1X BD Imag. Las células marcadas se centrifuga a 200 g, 4 ° C durante 5 minutos.
- Vortex la BD Imag partículas estreptavidina profundamente, agregue las partículas 40μl por cada 10 millones de células. Mezclar la partícula con las células marcadas bien e incubar las células a las 6 ~ 12 ° C durante 30 minutos. Esto permite que las partículas de estreptavidina para unirse a la biotina anti-CD54 y anti-CD90, que se une a las proteínas de superficie CD54 y CD90, respectivamente.
- Durante el tiempo de incubación, la etiqueta de un tubo de ensayo de fondo redondo para recoger la fracción positiva. Después de la incubación, llevar el volumen de etiquetado de 20 millones de células / ml con tampón 1X BD Imag y la transferencia de las células marcadas con el tubo de recogida de la fracción positiva. Coloque el tubo de la fracción positiva en el IMagnet BD y lo dejó permanecer durante 6 minutos, luego retire el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio con un tubo de la fracción positiva, todavía en el IMagnet BD.
- Retire el tubo de la fracción positiva de la IMagnet BD y colocarlo sobre hielo. Añadir 1 ml de hielo frío 1X tampón BD Imag y suspender las células mediante una mezcla suave. Coloque el tubo de nuevo en el IMagnet BD y lo dejó permanecer durante 2 o 4 minutos. Eliminar el sobrenadante con una pipeta de vidrio nuevo Pasteur. Repita el lavado como se describe en 2.5, una vez más.
- Retire el tubo de la IMagnet BD y suspender las células en medio de cultivo, las semillas de un frasco de 75 cm 2 para el mantenimiento de las células y un plato de 10 cm de citometría de flujo.
3. Verificación de expresión en la superficie del marcador por citometría de flujo
Análisis de citometría de flujo se realizó para comprobar que las células que expresan CD54 obtenidos y CD90. El HSC marcador CD45 fue utilizado para confirmar que el MSC se agotaron las CMH.
- Cuando las células se vuelven confluentes ~ 80%, trypsinize células con tripsina-EDTA y recoger las células en un tubo de 15 ml. Centrifugar a 200 g, 4 ° C durante 5 minutos para recoger las células.
- Aspirar el sobrenadante y seh células con D-PBS 1X vez. Resuspender las células en un tampón de tinción de células (D-1X PBS que contenía 2% de SFB y 0,05% de azida de sodio) para una concentración final de 5 a 10 millones de células / ml y mantener las células en hielo. Alícuota de 100μl de células en suspensión a los seis tubos etiquetados (1 sólo las células, 2. Control de isotipo IgG2a;.. 3 control de isotipo IgG1, 4 CD45; 5. CD54;.. 6 CD90).
- Agregar controles de isotipo y anticuerpos primarios en las concentraciones adecuadas (IgG2a e IgG1: 20μl por millón de células, CD45: 0.5μg por millón de células, CD54: 0.25μg por millón de células, CD90: 0.15μg por millón de células) e incubar a 4 ° C para 30 minutos.
- Lavar las células con PBS 1X-D dos veces y luego suspender las células en un tampón de 100μl tinción de las células. Añadir SA-PE (estreptavidina-ficoeritrina, use 0.15μg por millón de células) e incubar a 4 ° C durante 30 minutos en la oscuridad.
- Lave las células marcadas con D-PBS 1X dos veces. Resuspender las células en un tampón de 400μl tinción de las células y transferirlos a un tubo Falcon para el análisis de citometría de flujo.
4. La separación de una sola colonia Derivado MSC
MSC es una población heterogénea, integrada por diversos subgrupos de población con la forma de células diferentes, la tasa de crecimiento, así como la capacidad de diferenciación 6. Sin embargo, todas las subpoblaciones expresan los marcadores MSC conocidas y por lo tanto no es factible el uso de marcadores para separar estas subpoblaciones. Por lo tanto, hemos aplicado cilindros de clonación para separar las distintas subpoblaciones, que son colonias formadas por una sola célula.
- Células de la placa a unos 50 ~ 100 células por placa de 10 cm. Incubar en un 37 ° C y 5% de CO 2 incubadora de 1 a 2 semanas. Durante este período, examinar colonias bien aisladas con un microscopio invertido. Una vez que las colonias han alcanzado su tamaño lo suficientemente grande (mejor más de 100 células en cada colonia), marca las colonias con un rotulador en la parte inferior del plato. Al recoger la colonia a marcar, asegúrese de que no hay colonias cercanas a la recogió una.
- Aspirar a medio y lavar el plato una vez con D-PBS 1X. Recoger un cilindro de clonación estéril con una pinza estéril y suavemente a cabo alrededor de la colonia marcados. Repite esto hasta que todas las colonias marcadas tiene un cilindro colocado sobre la clonación. Las colonias elegido debe estar lejos de cada uno de esos otros que todos los cilindros de clonación sólo contiene una colonia.
- Agregar 100μl de tripsina-EDTA a cada cilindro clonación y poner el plato de nuevo a la incubadora de ~ 5 minutos. Después de 5 minutos, comprobar que las células bajo el microscopio para ver si son redondeo. Cuando las células se han levantado, para añadir la misma cantidad de medio de cultivo para inactivar la tripsina. Mezclar la suspensión celular con una micropipeta 200μl y la transferencia de la suspensión celular a un plato de 60 mm que contiene 3 ml medio de cultivo precalentado. Etiqueta de los platos correctamente y vuelva a colocarlas en la incubadora. El seguimiento de cambios morfológicos en los próximos días.
5. Resultados representante
De acuerdo con el protocolo descrito en la parte de rata aislada MSC, MSC plástico adherente debe ser visible al día siguiente después de la siembra. Como las células continúan proliferando, las células confluentes se parecen a las células se muestra en la Figura 1. Cuando las células alcanzan ~ 80% de confluencia (fig. 1B), subcultivo puede llevarse a cabo. Durante la subcultura, la tripsina-EDTA se utiliza para separar las células y las células levantado son pequeños y redondos, como se muestra en la Figura 1C.
Figura 1. Imágenes de contraste de fase de las MSC de la rata. (A) confluentes MSC. La mayoría de las células son fusiformes o en forma de estrella. (B) MSC alrededor del 80% de confluencia. (C), las células se suprimió después de tripsina son pequeñas y redondas.
Una vez que las MSCs son enriquecidos por la clasificación de células magnéticas, análisis de citometría de flujo se lleva a cabo para verificar las expresiones marcador de superficie. Si el enriquecimiento es bueno, las células que muestran una tinción positiva en contra de los marcadores CD54 y CD90 MSC, pero negativos contra el marcador CD45 HSC (Figura 2). Isotipo IgG2a e IgG1 controles se utilizaron como controles negativos.
Figura 2. Análisis de citometría de flujo de las MSC de marcadores de superficie. MSC fueron marcadas con anticuerpos contra IgG2a (control de isotipo 1), IgG1 (control de isotipo 2), CD45, CD54 y CD90. MSC expresaron CD54 y CD90, pero no CD45.
Cuando las células se sembraron a una densidad adecuada clonal, las colonias deben aumentar a partir de células individuales. La figura 3A representa una colonia formada por una sola célula. Cilindros de clonación se puede utilizar para separar las colonias y las células derivadas de las colonias pueden ser cultivadas por separado. Figura 3B y 3C representa las células derivadas de dos colonias. Las células derivadas de la colonia de un eje, como son (Figura 3 B), mientras que las células derivadas de la colonia 2 son redondos (Figura 3C).
Figura 3. La formación de colonias de MSC y una sola colonia de células derivadas. CMM cultivadas en las colonias de clones individuales de la densidad de la forma. Estas colonias pueden ser separados por cilindros de clonación y células de diferentes colonias se pueden cultivar por separado. (A) Un representante de la colonia formada por MSC cuando se siembran a una densidad clonal. (B) del eje, como las células derivadas de una colonia. (C), las células derivadas de la Ronda de otra colonia.
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Discussion
Este protocolo describe cómo aislar y enriquecer MSC. Un método para separar las células de una sola colonia de derivados también se ha incorporado. Hay varios pasos que son importantes para una separación exitosa de aislamiento, el enriquecimiento y la colonia. Mientras se hace el aislamiento de células de rata, se recomienda filtrar con un colador celular o una malla de nylon estéril de tamaño similar para deshacerse de los coágulos de sangre y restos óseos. Después de la siembra de las células durante la noche, muchas células muertas flotando en el medio y las células muertas se eliminan mediante la sustitución con un nuevo medio que debe ayudar al crecimiento de las células adjunto.
La célula magnética de clasificación en este protocolo se describe cómo realizar una selección positiva, y procedimientos similares se pueden utilizar para realizar una selección negativa. La cantidad de anticuerpos que se añade puede ser diferente y la optimización se requiere para lograr una mejor clasificación. Esto también es válido para el etiquetado de las células para el análisis de citometría de flujo. Si no se ejecuta el análisis de citometría de flujo para las muestras marcadas de inmediato, las muestras se puede fijar con 2% de formaldehído y ejecutarlo más tarde. Sin embargo, a largo plazo de almacenamiento no es recomendable ya que esto tiende a aumentar la auto-fluorescencia y la calidad de la muestra el sacrificio.
La parte clave para la separación de la colonia es la siembra a la densidad celular a la derecha (que debe optimizarse de forma experimental) y la localización de clones individuales que no están rodeados por otros clones. Si hay otros clones cercanos, el cilindro de la clonación puede abarcar los clones cercanos y las células obtenidas no serán de un clon. Al colocar el cilindro de la clonación en el clon, también tener cuidado de no se deslice sobre la superficie de la antena ya que esto hará que la grasa de silicona en la parte inferior del cilindro de la clonación para cubrir las células y prevenir la tripsina de llegar a las células para liberarlos.
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Acknowledgments
El trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Nacional de Salud (R01GM079688, R21RR024439 y R21GM075838), National Science Foundation (CBET 0941055), y la Fundación MSU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Biotin mouse IgG2a | BD Biosciences | 555572 | |
| Biotin mouse IgG1 | BD Biosciences | 555747 | |
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | |
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | |
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | |
| BD Imag buffer | BD Biosciences | 552362 | |
| Round-bottom tube | BD Biosciences | 352063 | |
| Streptavidin particles | BD Biosciences | 557812 | |
| SA-PE | R&D Systems | F0040 | |
| Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C2059 |
References
- de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells. J Neurochem. 91, 155-166 (2004).
- Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells. J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Kassem, M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther. 15, 109-116 (2008).
- Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. Krause Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 102, 3483-3493 (2003).
- Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).
