Summary
Rat MSCs wurden aus Oberschenkel-und Unterschenkelknochen isoliert und dann durch magnetische Zellsortierung angereichert. Sortiert Zellen wurden für die Expression der Oberflächenmarker durchflusszytometrisch bestätigt. Diese Zellen wurden auch bei klonaler Dichte kultiviert werden, um einzelne Kolonien bilden, und dann dieser Kolonien wurden durch Klonen Zylinder getrennt.
Abstract
MSCs sind eine Population von adulten Stammzellen, die eine vielversprechende Quelle für therapeutische Anwendungen geeignet ist. Diese Zellen können aus dem Knochenmark isoliert werden und lässt sich leicht aus den hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) aufgrund ihrer plastischen Einhaltung getrennt werden. Dieses Protokoll beschreibt, wie MSCs aus Ratten-Oberschenkel-und Unterschenkelknochen zu isolieren. Die isolierten Zellen wurden weiter gegen zwei MSCs Oberflächenmarker CD54 und CD90 durch magnetische Zellsortierung angereichert. Expression der Oberflächenmarker CD54 und CD90 wurden dann mittels Durchflusszytometrie-Analyse bestätigt. HSC CD45 wurde ebenfalls enthalten, um zu überprüfen, ob die sortierten MSCs von HSK aufgebraucht waren. MSCs sind natürlich sehr heterogen. Es gibt Subpopulationen von Zellen, die verschiedenen Formen, Proliferation und Differenzierung Fähigkeiten haben. Diese Subpopulationen alle exprimieren den bekannten MSC-Marker und keine eindeutige Marker noch für die verschiedenen Subpopulationen identifiziert worden. Daher ist ein alternativer Ansatz zur Abtrennung der verschiedenen Subpopulationen mit Klonzylinder zu trennen Single-Kolonie abgeleiteten Zellen. Die Zellen aus dem Single-Kolonien abgeleitet werden dann kultiviert und getrennt ausgewertet.
Protocol
1. Isolation der Rat MSCs
Mesenchymale Stammzellen wurden aus 6-8 Wochen alten Sprague-Dawley weiblichen Ratten wie oben beschrieben 1, 2 isoliert. Isolierte MSCs zu einer plastischen Oberfläche haften und leicht während in vitro-Kultur zu erweitern.
- Das Tier war in eine Narkose Kammer gestellt und betäubt für rund fünf Minuten. Während der Narkose, beobachten die Rate der blinkt, Atmung und die motorische Aktivität. Entfernen Sie das Tier aus der Kammer sofort nach motorischer Aktivität stoppt und die blinkende Rate wurde selten.
- Legen Sie das Tier sich auf eine Operation entfernt und tötet das Tier durch Genickbruch. Schneiden Sie die Oberschenkel-und Unterschenkelknochen von hinten Gliedmaßen, entfernen Sie die Haut und Muskeln.
- Setzen Sie den sezierten Oberschenkel-und Unterschenkelknochen in 70% Isopropanol für ein paar Sekunden und Transfer zum 1X D-PBS.
- In einem Biosicherheitswerkbank wurden die Oberschenkel-und Unterschenkelknochen eine 10cm Schüssel mit DMEM übertragen. Jeder Knochen wurde dann mit einer Pinzette gehalten und die beiden Enden offen waren mit einer Schere abgeschnitten. Bringen Sie eine 22G-Nadel auf eine 3ml Spritze und füllen Sie ihn mit DMEM, dann spülen Sie die Mark in eine 50 ml Tube, indem Sie die Nadel in einem offenen Ende des Knochens. Wiederholen Sie 2 bis 3 mal pro Knochen. Wenn alle Zucchini erhalten wurden, resuspendieren und übergeben Sie die Zellsuspension durch ein 70μm Zellsieb bis auf die Knochen Schmutz und Blut Aggregate zu entfernen.
- Spin down Zellen bei 200g, 4 ° C für 5 Minuten und entfernen Sie die Überstände durch Absaugen. Die Zellen in 25ml MSC-Medium (DMEM mit 10% FBS und 1% Pen-Strep). 10ml Zellsuspension wurde in jedem 10cm Kulturschale für insgesamt zwei Schalen ausgesät. Halten Sie den Kulturschalen in einem 37 ° C und 5% CO 2-Inkubator für 1 bis 2 Wochen. Medium wurde alle 2 bis 3 Tagen.
2. Anreicherung von Rat MSCs
Eine Reihe von Oberflächenproteinen wurden verwendet, um MSCs zu bereichern, einschließlich CD54, CD90, CD73, CD105 und CD271 3-5. In unserer Studie haben wir CD54 und CD90 als Marker für MSCs durch magnetische Zellsortierung bereichern.
- Wenn die Zellen etwa 80% Konfluenz erreicht, Saugen Sie das Medium und fügen 4 ~ 5 ml Trypsin-EDTA zu jedem Gericht. Legen Sie das Geschirr wieder in den Inkubator und inkubieren für rund 5 Minuten zum Ablösen der Zellen zu ermöglichen. Sobald Zellen wurden abgenommen, fügen Sie die gleiche Menge Kulturmedium zu Trypsin zu inaktivieren. Sammeln Zellsuspension in ein 15ml Tube und Spin Zellen nach unten auf 200g, 4 ° C für 5 Minuten.
- Die nächsten Schritte beschreiben, wie MSCs durch zwei Oberflächenmarker CD54 und CD90 bereichern gemäß dem Handbuch für die Zellseparation mittels BD IMagnet. Zellpellet wurde in Zellfärbung Puffer (3% hitzeinaktiviertem FBS in 1X D-PBS) bei 20 Millionen Zellen / ml resuspendiert. Biotinylierten CD54-Antikörper (0.25μg pro Million Zellen) und biotinylierten CD90-Antikörper (0.15μg pro Million Zellen) zugegeben und vorsichtig mit der Zellsuspension gemischt. Nach der Inkubation auf Eis für 15 Minuten wurden die markierten Zellen mit einem Überschuss Volumen von 1X BD Imag gewaschen. Die markierten Zellen wurden bei 200g gesponnen, 4 ° C für 5 Minuten.
- Vortex die BD Imag Streptavidin Partikel gründlich, fügen Sie 40 ul Partikel für alle 10 Millionen Zellen. Mix der Partikel mit der markierten Zellen gründlich und inkubieren Sie die Zellen bei 6 ~ 12 ° C für 30 Minuten. Dies ermöglicht dem Streptavidin Partikel zu binden die biotinylierten anti-CD54 und anti-CD90, das auf der Oberfläche Proteine CD54 und CD90 gebunden ist jeweils.
- Während der Inkubationszeit Label ein Rundboden-Röhrchen, die positive Fraktion zu sammeln. Nach der Inkubation bringen die Kennzeichnung Volumen bis 20 Millionen Zellen / ml mit 1X BD Imag Puffer und übertragen Sie die markierten Zellen, die positiv-Fraktion Sammelrohr. Legen Sie die positive-Fraktion Tube auf den BD IMagnet und lassen Sie es bleiben für 6 Minuten, dann entfernen Sie den Überstand mit einem Glas Pasteurpipette mit der Positiv-Fraktion Röhre immer noch auf der BD IMagnet.
- Entfernen Sie die positive-Fraktion Rohr aus dem BD IMagnet und legen Sie sie auf Eis. 1ml eiskaltem 1X BD Imag Puffer und die Zellen durch vorsichtiges Mischen. Das Röhrchen wieder auf die BD IMagnet und lassen Sie es für 2 ~ 4 Minuten zu bleiben. Entfernen Sie den Überstand mit einem neuen Glas-Pasteur-Pipette. Wiederholen Sie die Wäsche wie in 2.5 noch einmal beschrieben.
- Entfernen Sie den Schlauch aus dem BD IMagnet und die Zellen in Kulturmedium, Saatgut ein 75cm 2 Flasche für die Erhaltung der Zellen und eine 10cm Schüssel für die Durchflusszytometrie.
3. Überprüfung der Surface Marker Expression mittels Durchflusszytometrie
Durchflusszytometrie-Analyse wurde durchgeführt, um die Zellen erhielten wir ausdrücken CD54 und CD90 zu überprüfen. Die HSC-Marker CD45 verwendet wurde, um zu bestätigen, dass die MSCs von HSK waren erschöpft.
- Wenn Zellen ~ 80% konfluent geworden, trypsinize Zellen mit Trypsin-EDTA und sammeln Zellen in ein 15ml Tube. Zentrifugation bei 200g, 4 ° C für 5 Minuten, um Zellen zu sammeln.
- Saugen Sie den Überstand und wurdeh Zellen mit 1x D-PBS einmal. Die Zellen in Zellfärbung Puffer (1X D-PBS mit 2% FBS und 0,05% Natriumazid) auf eine Endkonzentration von 5 ~ 10 Mio. Zellen / ml und halten Zellen auf Eis. Aliquot 100 &mgr; Zellsuspension in den sechs beschrifteten Röhrchen (1 Zellen nur;. 2 Isotypkontrolle IgG2a;.. 3 Isotypkontrolle IgG1, 4 CD45;. 5 CD54;.. 6 CD90).
- Add Isotypkontrollen und primären Antikörpern bei entsprechenden Konzentrationen (IgG2a und IgG1: 20 &mgr; l pro Million Zellen; CD45: 0.5μg pro Million Zellen; CD54: 0.25μg pro Million Zellen; CD90: 0.15μg pro Million Zellen) und inkubieren Sie bei 4 ° C für 30 Minuten.
- Wash-Zellen mit 1x D-PBS zweimal und dann die Zellen in 100 &mgr; Zellfärbung Puffer. Fügen Sie SA-PE (Streptavidin-Phycoerythrin, verwenden 0.15μg pro Million Zellen) und inkubieren Sie bei 4 ° C für 30 Minuten im Dunkeln.
- Wash markierten Zellen mit 1x D-PBS zweimal. Die Zellen in 400μl Zelle Färbepuffer und in ein Falcon-Röhrchen für die Durchflusszytometrie-Analyse.
4. Trennung von Einzel-Kolonie Derived MSCs
MSCs ist eine heterogene Population von verschiedenen Subpopulationen mit verschiedenen Zell-Form, Wachstum und die Differenzierung Fähigkeit 6 zusammen. Allerdings äußern alle Subpopulationen der bekannten MSC Marker und daher ist es nicht möglich, Marker verwenden zu trennen diese Subpopulationen. Deshalb wandten wir Klonzylinder zur Abtrennung der verschiedenen Bevölkerungsgruppen, die Kolonien, die von einzelnen Zellen gebildet werden.
- Platte Zellen bei etwa 50 ~ 100 Zellen pro 10cm Schüssel. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2-Inkubator für 1 bis 2 Wochen. Während dieser Zeit prüfen, gut isolierte Kolonien mit einem inversen Mikroskop. Nachdem die Kolonien groß genug Größe (besser mehr als 100 Zellen in jeder Kolonie) erreicht haben, markieren Sie die Kolonien mit einem sharpie am unteren Rand der Schale. Wenn die Kolonie markiert werden, stellen Sie sicher, es gibt keine umliegenden Kolonien in der Nähe des abgeholt eins.
- Saugen Sie mittel-und waschen Sie die Schale einmal mit 1x D-PBS. Pick-up einer sterilen Klonen Zylinder mit einer sterilen Pinzette und legen Sie sie vorsichtig um die markierte Kolonie. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle markierten Kolonien hat ein Klonen Zylinder angeordnet vorbei. Die abgeholt Kolonien weit entfernt von einander, so dass jeder das Klonen Zylinder enthält nur eine Kolonie.
- Add 100 &mgr; Trypsin-EDTA zu jedem Klonen Zylinder und die Schüssel wieder in den Inkubator für ~ 5 Minuten. Nach 5 Minuten überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop zu sehen, ob sie Rundung auf. Wenn die Zellen hob, fügen Sie die gleiche Menge Kulturmedium zu Trypsin zu inaktivieren. Mischen Sie die Zellsuspension mit einer 200 ul Mikropipettierer und übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 60mm Schale mit 3 ml vorgewärmtem Kulturmedium. Beschriften Sie die Speisen richtig und lege sie wieder in den Inkubator. Tracking-morphologische Veränderungen im Laufe der nächsten Tage.
5. Repräsentative Ergebnisse
Nach dem Protokoll in dem Teil für Ratten MSCs Isolation beschrieben, sollten Kunststoff-adhärenten MSCs sichtbar am nächsten Tag nach dem Ausplattieren. Wie Zellen sich zu vermehren fortzusetzen, sollte die konfluenten Zellen wie die Zellen in Abbildung 1A dargestellt aussehen. Wenn die Zellen zu erreichen ~ 80% Konfluenz (Abbildung 1B), kann Subkultivierung durchgeführt werden. Während Subkultur wurde Trypsin-EDTA verwendet, um Zellen zu lösen und hob Zellen sind klein und rund, wie in Abbildung 1C gezeigt.
Abbildung 1. Phasenkontrast-Bilder von Ratten MSCs. (A) Confluent MSCs. Die Mehrzahl der Zellen sind spindelförmige oder sternförmige. (B) MSCs rund 80% Konfluenz. (C) Lifted Zellen nach Trypsinierung sind klein und rund.
Sobald MSCs durch magnetische Zellsortierung angereichert sind, ist die Durchflusszytometrie-Analyse durchgeführt, um die Oberfläche Marker Ausdrücke zu überprüfen. Wenn die Anreicherung gut ist, sollten die Zellen positive Färbung gegen MSC Marker CD54 und CD90, aber negativ gegen die HSC-Marker CD45 (Abbildung 2) zeigen. Isotypkontrollen IgG2a und IgG1 werden als negative Kontrollen verwendet.
Abbildung 2. Durchflusszytometrie Analyse von MSCs für Oberflächen-Marker. MSCs wurden mit Antikörpern gegen IgG2a (Isotyp-Kontrolle 1), IgG1 (Isotyp-Kontrolle 2), CD45, CD54 und CD90 markiert. MSCs exprimiert CD54 und CD90, aber nicht CD45.
Wenn die Zellen am richtigen klonaler Dichte ausgesät werden, sollten Kolonien aus einzelnen Zellen steigen. 3A ist eine Kolonie, die von einer einzigen Zelle gebildet. Cloning Zylinder kann dann zur Trennung der Kolonien und Zellen aus den Kolonien abgeleitet getrennt kultiviert werden. 3B und 3C stellt Zellen aus zwei einzelnen Kolonien stammen. Die Zellen aus Kolonie 1 abgeleitet sind Spindel wie (3B), während die Zellen aus Kolonie 2 abgeleitet rund sind (Abb. 3C).
Abbildung 3. Colony Formation von MSCs und Single-Kolonie abgeleiteten Zellen. MSCs bei klonaler Dichte zu bilden einzelne Kolonien kultiviert. Diese Kolonien können durch Klonen Zylindern und Zellen aus verschiedenen Kolonien getrennt werden können getrennt kultiviert werden. (A) Ein Vertreter Kolonie von MSCs entsteht, wenn bei klonaler Dichte ausplattiert. (B) Spindel-ähnliche Zellen aus einer Kolonie abgeleitet. (C) Round-Zellen aus einer anderen Kolonie abgeleitet.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie zu isolieren und zu bereichern MSCs. Eine Methode, um die Single-Kolonie abgeleiteten Zellen trennen, ist ebenfalls integriert. Es gibt mehrere Schritte, die wichtig sind für eine erfolgreiche Isolierung, Anreicherung und Trennung Kolonie. Währenddessen Zelle isoliert von Ratten, empfiehlt es sich, durch eine Zelle Sieb oder eine sterile Nylon-Mesh von ähnlicher Größe, um loszuwerden, das Blut gerinnt und Knochendebris Filter. Nach Ausplattieren der Zellen über Nacht werden viele tote Zellen im Medium zu schweben und die toten Zellen werden durch den Austausch mit frischem Medium, das das Wachstum der anhaftenden Zellen helfen, sollten entfernt werden.
Die magnetische Zellsortierung in diesem Protokoll beschrieben, wie eine positive Selektion durchzuführen, und ähnliche Verfahren können verwendet werden, um eine negative Selektion durchzuführen. Die Höhe der Antikörper hinzugefügt werden können abweichen und Optimierung erforderlich ist, um eine bessere Sortierung zu erreichen. Dies gilt auch für die Beschriftung der Zellen für die Durchflusszytometrie wahr. Wenn nicht läuft Durchflusszytometrie-Analyse für die markierten Proben sofort können Proben mit 2% Formaldehyd fixiert und laufen später. Allerdings ist die langfristige Lagerung nicht empfohlen, da dieser dazu neigt, die Autofluoreszenz und Opfer Probe Qualität zu erhöhen.
Der wichtigste Teil für die Kolonie Trennung ist auf der rechten Zelldichte Aussaat (die experimentell optimiert werden) und Ortung einzelner Klone, die nicht durch andere Klone umgeben sind. Wenn es andere Klone sind in der Nähe, kann das Klonen Zylinder umfassen die in der Nähe Klone und die erhaltenen Zellen werden nicht mehr von einem Klon werden. Beim Anbringen des Klonens Zylinder über den Klon, auch darauf achten, nicht um es über den Teller gleiten, da dies die Silikonfett an der Unterseite des Klonens Zylinder dazu führen, dass die Zellen Abdeckung und verhindern, dass die Trypsin vom Erreichen der Zellen, um sie zu lösen.
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Acknowledgments
Die Arbeit wurde teilweise durch National Institute of Health (R01GM079688, R21RR024439 und R21GM075838), National Science Foundation (CBET 0941055) und der MSU-Stiftung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Biotin mouse IgG2a | BD Biosciences | 555572 | |
| Biotin mouse IgG1 | BD Biosciences | 555747 | |
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | |
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | |
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | |
| BD Imag buffer | BD Biosciences | 552362 | |
| Round-bottom tube | BD Biosciences | 352063 | |
| Streptavidin particles | BD Biosciences | 557812 | |
| SA-PE | R&D Systems | F0040 | |
| Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C2059 |
References
- de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells. J Neurochem. 91, 155-166 (2004).
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- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Kassem, M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther. 15, 109-116 (2008).
- Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. Krause Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 102, 3483-3493 (2003).
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