Summary
Rat MSC ont été isolés à partir des fémurs et tibias et ensuite enrichi par tri cellulaire magnétique. Cellules triées ont été confirmés pour l'expression des marqueurs de surface par cytométrie en flux. Ces cellules ont également été cultivées à une densité clonale pour former des colonies isolées et ensuite ces colonies ont été séparés par des cylindres de clonage.
Abstract
MSC sont une population de cellules souches adultes qui est une source prometteuse pour des applications thérapeutiques. Ces cellules peuvent être isolées de la moelle osseuse et peut facilement être séparé des cellules souches hématopoïétiques (CSH) en raison de leur adhésion en plastique. Ce protocole décrit comment isoler des MSC à partir des fémurs et des tibias de rats. Les cellules isolées ont été encore enrichie contre deux marqueurs de surface CD54 et CD90 MSC par tri cellulaire magnétique. L'expression de marqueurs de surface CD54 et CD90 ont ensuite été confirmés par une analyse de cytométrie en flux. HSC marqueur CD45 a également été inclus pour vérifier si les cellules souches mésenchymateuses ont été triés appauvri de CSH. MSC sont naturellement très hétérogènes. Il ya des sous-populations de cellules qui ont des formes différentes, la prolifération et les capacités de différenciation. Ces sous-populations expriment tous les marqueurs connus MSC et aucun marqueur unique n'a pas encore été identifiés pour la sous-populations différentes. Par conséquent, une approche alternative pour séparer les différentes sous-populations est d'utiliser le clonage cylindres de séparer une seule colonie de cellules dérivées. Les cellules provenant de colonies unique peut alors être cultivées et évaluées séparément.
Protocol
1. L'isolement des cellules souches mésenchymateuses Rat
Les cellules souches mésenchymateuses ont été isolés de 6-8 semaines Sprague-Dawley rats femelles, comme décrit précédemment 1, 2. Isolée MSC peuvent adhérer à la surface en plastique et facilement développer durant la culture in vitro.
- L'animal a été mis dans une chambre de l'anesthésie et anesthésiés pendant environ cinq minutes. Pendant l'anesthésie, d'observer le taux de clignoter, la respiration et l'activité motrice. Retirez les animaux de la chambre immédiatement après il arrête l'activité motrice et le taux de clignotement est devenu rare.
- Lay de l'animal vers le bas sur une station de fonctionnement et de tuer l'animal par dislocation cervicale. Coupez les fémurs et des tibias du membres arrière, enlever la peau et les muscles.
- Mettez les fémurs et des tibias disséqué dans 70% d'isopropanol pendant quelques secondes et le transfert à D-1X PBS.
- Dans une enceinte de sécurité biologique, les fémurs et tibias ont été transférés à un plat de 10cm contenant du DMEM. Chaque os a ensuite eu lieu avec des pincettes et les deux extrémités ont été coupés avec des ciseaux ouverts. Fixer une aiguille 22G sur une seringue de 3 ml et remplissez-le avec du DMEM, puis rincer la moelle dans un tube de 50ml en insérant l'aiguille à une extrémité ouverte de l'os. Répétez 2 à 3 fois pour chaque os. Lorsque tous les courges ont été obtenus, remettre les cellules et passer la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire 70μm pour enlever les débris osseux et des agrégats de sang.
- Isoler les cellules à 200 g, 4 ° C pendant 5 minutes et retirer le surnageant par aspiration. Resuspendre les cellules dans 25ml MSC (DMEM contenant 10% de FBS et 1% de Pen-Strep). Suspension cellulaire 10ml a été ensemencées dans chaque boîte de culture 10cm pour un total de deux plats. Gardez les boîtes de culture dans un 37 ° C et 5% de CO 2 incubateur pour 1 ~ 2 semaines. Le milieu est changé tous les 2 ~ 3 jours.
2. Enrichissement des cellules souches mésenchymateuses Rat
Un certain nombre de protéines de surface ont été utilisés pour enrichir les MSC, dont CD54, CD90, CD73, CD105 et CD271 3-5. Dans notre étude, nous avons utilisé CD54 et le CD90 en tant que marqueurs pour enrichir MSC par tri cellulaire magnétique.
- Lorsque les cellules ont atteint environ 80% de confluence, aspirer le moyen et ajouter les 4 ~ 5 ml de trypsine-EDTA à chaque plat. Mettez les plats de retour à l'incubateur et incuber pendant environ 5 minutes afin de permettre le détachement des cellules. Une fois que les cellules ont été détachées, ajouter la même quantité de milieu de culture pour inactiver la trypsine. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15ml et les cellules spin down au 200g, 4 ° C pendant 5 minutes.
- Les étapes suivantes décrivent comment enrichir MSC par deux marqueurs de surface CD54 et CD90 selon le manuel pour la séparation cellulaire utilisant BD IMagnet. Culot cellulaire a été resuspendu dans un tampon de coloration des cellules (FBS 3% de la chaleur inactivé dans D-1X PBS) à 20 millions de cellules / ml. Biotinylé CD54 anticorps (0.25μg par million de cellules) et CD90 biotinylé anticorps (0.15μg par million de cellules) a été ajoutée et mélangée doucement avec la suspension cellulaire. Après incubation sur la glace pendant 15 minutes, les cellules marquées ont été lavées avec un volume de plus de 1X BD Imag tampon. Les cellules marquées ont été centrifugés à 200g, 4 ° C pendant 5 minutes.
- Vortex, le BD Imag particules streptavidine fond, on ajoute des particules de 40μl pour 10 millions de cellules. Mélanger la particule avec les cellules marquées soigneusement et incuber les cellules à 6 ~ 12 ° C pendant 30 minutes. Cela permet à la streptavidine particules de se lier à l'biotinylé anti-CD54 et anti-CD90, ce qui est lié à des protéines de surface CD54 et CD90, respectivement.
- Pendant le temps d'incubation, l'étiquette un tube à essai à fond rond pour recueillir la fraction positive. Après incubation, porter le volume d'étiquetage pour 20 millions de cellules / ml avec du tampon 1X BD Imag et le transfert des cellules marquées sur le tube de collecte positive de fraction. Placez le tube de la fraction positive sur le IMagnet BD et laissez-le rester pendant 6 minutes, puis enlever le surnageant avec une pipette Pasteur en verre avec un tube de la fraction positive toujours sur la IMagnet BD.
- Retirer le tube fraction positive-du IMagnet BD et le placer sur la glace. Ajouter 1ml glacée 1X BD Imag tampon et remettre les cellules en mélangeant doucement. Placer le tube de retour sur le IMagnet BD et laissez-le séjour pour 2 ~ 4 minutes. Enlever le surnageant avec une nouvelle pipette Pasteur en verre. Répétez le lavage comme décrit dans 2.5 une fois de plus.
- Enlevez le tube de l'IMagnet BD et remettre les cellules en milieu de culture, semences une 75cm 2 flacon pour maintenir les cellules et un plat de 10cm pour la cytométrie en flux.
3. Vérification de l'expression du marqueur de surface par cytométrie en flux
L'analyse par cytométrie en flux a été réalisée afin de vérifier les cellules, nous avons obtenu d'exprimer CD54 et CD90. Le marqueur CD45 HSC a été utilisée pour confirmer que les cellules souches mésenchymateuses ont été épuisés de CSH.
- Lorsque les cellules deviennent confluentes ~ 80%, trypsiniser cellules à la trypsine-EDTA et prélever des cellules dans un tube de 15ml. Centrifuger à 200 g, 4 ° C pendant 5 minutes pour collecter les cellules.
- Aspirer le surnageant et a étécellules h avec D-1X PBS fois. Resuspendre les cellules dans un tampon de coloration des cellules (D-1X PBS contenant 2% de FBS et de l'azide de sodium à 0,05%) à une concentration finale de 5 ~ 10 millions de cellules / ml et garder les cellules sur la glace. Suspension cellulaire Aliquoter 100 ul dans les six tubes étiquetés (1 cellules seulement; 2. Isotype contrôle IgG2a;.. 3 contrôle isotypique IgG1; 4 CD45; 5. CD54;.. 6 CD90).
- Ajouter des contrôles isotype et anticorps primaires à des concentrations appropriées (IgG2a et IgG1: 20 pi par million de cellules; CD45: 0.5μg par million de cellules; CD54: 0.25μg par million de cellules; CD90: 0.15μg par million de cellules) et incuber à 4 ° C pour 30 minutes.
- Laver les cellules avec du D-PBS 1X à deux reprises et ensuite remettre les cellules dans un tampon de coloration cellulaire 100 ul. Ajouter SA-PE (streptavidine-phycoérythrine, utilisez 0.15μg par million de cellules) et incuber à 4 ° C pendant 30 minutes dans l'obscurité.
- Laver les cellules marquées avec les D-1X PBS deux fois. Resuspendre les cellules dans un tampon de coloration cellulaire 400μl et transférer dans un tube falcon pour l'analyse de cytométrie en flux.
4. Séparation des dérivés mono-colonie MSC
MSC est une population hétérogène composée de différentes sous-populations de cellules de forme différente, le taux de croissance ainsi que la capacité de différenciation 6. Cependant, tous les sous-populations expriment les marqueurs CSM connue et donc il n'est pas possible d'utiliser des marqueurs pour séparer ces sous-populations. Par conséquent, nous avons appliqué le clonage cylindres de séparer les différentes sous-populations, qui sont des colonies formées par des cellules individuelles.
- Cellules de la plaque à environ 50 ~ 100 cellules par boîte de 10 cm. Incuber dans un 37 ° C et 5% de CO 2 incubateur pour 1 ~ 2 semaines. Durant cette période, d'examiner des colonies bien isolées avec un microscope inversé. Une fois que les colonies ont atteint assez grande taille (plus de plus de 100 cellules dans chaque colonie), marquer les colonies avec un Sharpie au fond du plat. Lorsque prélever la colonie à être marqué, assurez-vous qu'il n'y a pas de colonies environnantes à proximité de celui choisi.
- Aspirer moyennes et laver la vaisselle une fois avec D-1X PBS. Ramassez une bouteille de clonage stériles avec une pince stérile et doucement le placer autour de la colonie marquée. Répétez jusqu'à ce que toutes les colonies marquée a un cylindre placé sur le clonage. Les colonies doivent être cueillies loin les uns des autres tels que chaque bouteille de clonage ne contient qu'une seule colonie.
- Ajouter 100 ul de trypsine-EDTA à chaque cylindre de clonage et de mettre le plat de retour à l'incubateur pour ~ 5 minutes. Après 5 minutes, vérifier les cellules sous le microscope pour voir si elles sont arrondissant. Lorsque les cellules ont levé, ajouter la même quantité de milieu de culture pour inactiver la trypsine. Mélanger la suspension cellulaire avec une micropipette 200 pl et le transfert de la suspension cellulaire dans un plat contenant 3ml 60mm milieu de culture préchauffé. Étiqueter les plats correctement et remettez-les dans l'incubateur. Suivi des changements morphologiques au cours des prochains jours.
5. Les résultats représentatifs
Selon le protocole décrit dans la partie pour le rat MSC isolement, en plastique MSC adhérente doit être visible dès le lendemain après le placage. Comme les cellules continuent de proliférer, les cellules confluentes devrait ressembler à des cellules de la figure 1A. Lorsque les cellules atteignent environ 80% de confluence (figure 1B), repiquage peut être effectué. Pendant subculture, la trypsine-EDTA a été utilisé pour détacher les cellules et les cellules levées sont petites et rondes comme le montre la figure 1C.
Figure 1. Des images à contraste de phase des cellules souches mésenchymateuses de rats. (A) MSC Confluent. La majorité des cellules sont de broche-like ou en étoile. (B) MSC environ 80% de confluence. (C) des cellules levée après trypsinisation sont petits et ronds.
Une fois que les MSC sont enrichies par le tri magnétique de cellules, l'analyse par cytométrie en flux est effectué pour vérifier les expressions marqueur de surface. Si l'enrichissement est bonne, les cellules doivent montrer coloration positive contre des marqueurs CD54 et CD90 MSC, mais négatif par rapport au marqueur CD45 HSC (figure 2). Contrôle isotypique IgG2a et IgG1 sont utilisés comme témoins négatifs.
Figure 2. L'analyse par cytométrie en flux des cellules souches mésenchymateuses pour les marqueurs de surface. MSC ont été marquées avec des anticorps contre IgG2a (isotype contrôle 1), IgG1 (isotype contrôle 2), CD45, CD54 et CD90. MSC a exprimé CD54 et CD90 mais pas CD45.
Lorsque les cellules sont ensemencées à densité clonale appropriée, les colonies devraient passer de cellules individuelles. La figure 3A représente une colonie formée par une seule cellule. Cylindres de clonage peuvent ensuite être utilisées pour séparer les colonies et les cellules provenant de colonies peuvent être cultivées séparément. Figure 3B et 3C représente cellules provenant de deux colonies individuelles. Les cellules provenant de la colonie sont une broche comme (figure 3B) alors que les cellules dérivées de la colonie 2 sont ronds (figure 3C).
Figure 3. Formation de colonies par MSC et unique colonie de cellules dérivées. MSC en culture à la densité des colonies clonales individuels formulaire. Ces colonies peuvent être séparés par des cylindres de clonage et les cellules provenant de colonies différentes peuvent être cultivées séparément. (A) Une colonie représentative formé par MSC lors plaquées à une densité clonale. (B) Spindle-like des cellules dérivées d'une colonie. (C) cellules rondes dérivées d'une autre colonie.
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Discussion
Ce protocole décrit comment isoler et d'enrichir les MSC. Une méthode pour séparer les cellules mono-colonie dérivée est également intégré. Il ya plusieurs étapes qui sont importantes pour une séparation réussie l'isolement, l'enrichissement et la colonie. Tout en faisant l'isolement cellulaire de rat, il est recommandé de filtrer à travers une passoire cellule ou une maille de nylon stérile de taille similaire pour se débarrasser des caillots de sang et de débris osseux. Après étalement des cellules pendant la nuit, de nombreuses cellules mortes seront flottant dans le milieu et les cellules mortes sont éliminées en remplaçant par du milieu frais qui devraient aider la croissance des cellules ci-joint.
La cellule magnétique de tri dans ce protocole décrit comment effectuer une sélection positive, et des procédures semblables peuvent être utilisés pour effectuer une sélection négative. La quantité d'anticorps à ajouter peut varier et d'optimisation est nécessaire pour atteindre un meilleur tri. Cela est également vrai pour l'étiquetage des cellules pour une analyse de cytométrie en flux. Si l'analyse ne tourne pas la cytométrie en flux pour les échantillons étiquetés immédiatement, les échantillons peuvent être fixées au formaldéhyde à 2% et d'exécuter plus tard. Cependant, à long terme de stockage n'est pas recommandée car elle tend à accroître l'auto-fluorescence et la qualité des échantillons de sacrifice.
L'élément clé pour la séparation colonie est l'ensemencement à la densité des cellules à droite (qui devrait être optimisé expérimentalement) et la localisation des clones individuels qui ne sont pas entourés par des clones d'autres. S'il ya d'autres clones à proximité, le cylindre de clonage peut englober les clones proches et les cellules obtenues ne seront plus d'un clone. En plaçant le cylindre de clonage sur le clone, également veiller à ne pas glisser sur la surface plat comme cela va provoquer la graisse silicone au fond du cylindre de clonage pour couvrir les cellules et éviter la trypsine d'atteindre les cellules pour les détacher.
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Acknowledgments
Le travail a été soutenu en partie par l'Institut national de la Santé (R01GM079688, R21RR024439 et R21GM075838), la National Science Foundation (EFAC 0.941.055), et la Fondation MSU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Biotin mouse IgG2a | BD Biosciences | 555572 | |
| Biotin mouse IgG1 | BD Biosciences | 555747 | |
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | |
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | |
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | |
| BD Imag buffer | BD Biosciences | 552362 | |
| Round-bottom tube | BD Biosciences | 352063 | |
| Streptavidin particles | BD Biosciences | 557812 | |
| SA-PE | R&D Systems | F0040 | |
| Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C2059 |
References
- de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells. J Neurochem. 91, 155-166 (2004).
- Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells. J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Kassem, M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther. 15, 109-116 (2008).
- Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. Krause Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 102, 3483-3493 (2003).
- Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).
