ラット間葉系幹細胞（MSC）とMSCを派生シングルコロニーの分離の分離と濃縮

Summary

ラットMSCを、大腿骨と脛骨から分離し、磁気細胞ソーティングで濃縮した。ソートされた細胞はフローサイトメトリーによる表面マーカーの発現について確認した。これらの細胞はまた、単一のコロニーを形成するためにクローン密度で培養した後、これらのコロニーをクローニングシリンダーにより分離した。

Abstract

MSCは、治療用途のための有望な源である成体幹細胞の集団である。これらの細胞は、骨髄から単離することができると簡単に、プラスチック接着による造血幹細胞（HSC）から分離することができる。このプロトコルは、ラットの大腿骨と脛骨からMSCを分離する方法について説明します。分離した細胞をさらに磁気細胞選別して、2つのMSCの表面マーカーCD54とCD90に対する濃縮した。表面マーカーCD54とCD90の発現は、フローサイトメトリー分析によって確認した。 HSCマーカーCD45はまた、ソートされたMSCのが造血幹細胞が枯渇していたかどうかを確認するために含まれていた。 MSCは、自然にかなり異質です。さまざまな形状、増殖および分化能力を有する細胞の亜集団がある。これらの亜集団は、すべての既知のMSCのマーカーを発現していないユニークなマーカーはまだ異なる部分母集団に同定されていない。したがって、別の亜集団を分離するための代替アプローチは、単一コロニー由来の細胞を分離するためにクローニングシリンダーを使用しています。シングルコロニーに由来する細胞を培養すると別々に評価することができます。

Protocol

1。ラットMSCの単離

間葉系幹細胞は、以前は^1で説明した6〜8週齢のSprague - Dawley雌ラット^、2から分離された。隔離されたMSCは、プラスチック表面に付着し、容易にin vitro培養中に展開することができます。

1. 動物は、麻酔室に入れ、約5分間麻酔した。麻酔中は、点滅して、呼吸と運動の速度を観察。それは運動を停止すると点滅速度が頻繁になった直後にチャンバーから動物を取り外します。
2. 操作ステーションで動物を下に置くと、頚椎脱臼により動物を殺す。バック手足から大腿骨と脛骨を切って、皮膚と筋肉を取り除く。
3. 数秒と1 × D - PBSに転送するためにイソプロパノール70％で解剖大​​腿骨と脛骨を置く。
4. バイオセーフティキャビネットでは、大腿骨と脛骨をDMEMを含む10 cmディッシュに移した。それぞれの骨は、その後、ピンセットで開催され、両端はハサミで切開した。 3ミリリットルシリンジに22G針を添付し、DMEMでそれを埋める、そして骨の一つ開放端に針を挿入して50ミリリットルチューブに骨髄をフラッシュします。 〜3回、各骨を繰り返します2。すべての髄が得られたときに、細胞を再懸濁し、骨の破片と血液の凝集物を除去するために70μmセルストレーナーを通して細胞懸濁液を渡します。
5. 200グラムで細胞を、5分間、4℃の回転を停止し、吸引により上清を取り除く。 25ミリリットルのMSC培地で再懸濁し、細胞（DMEM、10％FBS、1％ペン連鎖球菌を含む）。 10mlの細胞懸濁液は、2つの皿の合計のために各10cmの培養皿に播種した。 1〜2週間で37℃、5％CO ₂インキュベーターで培養皿をおいてください。培地は2〜3日ごとに変更されました。

2。ラットMSCの濃縮

表面タンパク質の数は、CD54、CD90、CD73、CD105やCD271 ^3月5日を含めて、MSCを豊かにするために使用されている。私たちの研究では、磁気細胞選別によって、MSCを豊かにするためのマーカーとしてCD54とCD90を使用していました。

1. 細胞がコンフルエントに約80％に達したとき、培地を吸引し、各シャーレに4〜5ミリリットルトリプシン- EDTAを加える。インキュベーターに戻し皿を置き、細胞の剥離を可能にするために約5分間インキュベートする。細胞が切り離された後、トリプシンを不活化するために培養液の同量を追加します。 5分間、4℃、200グラムで15ミリリットルチューブとスピンの細胞下に細胞懸濁液を収集する。
2. 次の手順では、BD IMagnetを用いた細胞分離のためのマニュアルに従って、2つの表面マーカーCD54とCD90でMSCを豊かにする方法について説明します。細胞ペレットを20万細胞/ mlで細胞を染色バッファー（1X D - PBSで3％の熱不活化FBS）中に再懸濁した。ビオチン化CD54抗体（0.25μg百万分の一の細胞）とビオチン化CD90抗体（万個の細胞あたり0.15μg）を添加し、細胞懸濁液を穏やかに混合した。 15分間氷上でインキュベートした後、標識された細胞を1X BD IMAGバッファの過剰量で洗浄した。標識された細胞を5分間、4℃200グラムでスピンダウンされました。
3. 渦BD IMAGストレプトアビジン粒子は完全に、すべての10万個の細胞に対して40μlの粒子を追加してください。徹底的に標識された細胞と粒子を混合し、6〜12で細胞をインキュベート℃で30分間。これにより、ストレプトアビジン粒子はそれぞれ表面タンパク質CD54とCD90にバインドされているビオチン化抗CD54および抗CD90に結合することができます。
4. インキュベーション時間の間に、正の分数を収集するための丸底試験管にラベルを付けます。インキュベーション後、1 × BD IMAGバッファを20万細胞/ mlにラベリングのボリュームをもたらすと正のフラクションコレクションチューブに標識された細胞を移す。 BDのIMagnetにポジティブフラクションチューブを配置し、6分間滞在させ、その後も、BDのIMagnet上で正のフラクションチューブにガラスパスツールピペットで上清を取り除く。
5. BDのIMagnetからポジティブフラクションチューブを外し、氷の上に置きます。 1ミリリットルの氷冷1 × BD IMAGバッファと穏やかに混合して再懸濁し、細胞を追加。 BD IMagnetに戻ってチューブを置き、それが2〜4分の滞在ができます。新しいガラスパスツールピペットで上清を取り除きます。 2.5つのより多くの時間で説明するように洗浄を繰り返します。
6. 、培養培地中にBD IMagnetを再懸濁します細胞からチューブを外しシード細胞とフローサイトメトリー用の10cmディッシュを維持用の75センチメートル²フラスコ。

3。フローサイトメトリーによる表面マーカーの発現の検証

フローサイトメトリー分析は、我々が明示CD54とCD90を得られる細胞を確認するために実施した。 HSCマーカーCD45はMSCが造血幹細胞が枯渇していたことを確認するために使用されていました。

1. 細胞がコンフルエント〜80％になると、トリプシン- EDTAで細胞をトリプシン処理し、15ミリリットルチューブに細胞を集める。 ° Cで5分間、細胞を収集するために200グラム、4で遠心分離します。
2. 上清を吸引していたかつて1X D - PBSでH細胞。 5の最終濃度が約10万細胞/ mlにし、氷上で細胞を維持する細胞の染色バッファーに再懸濁し細胞（1 × D - PBS、2％FBS、0.05％アジ化ナトリウムを含む）。 （。、2アイソタイプコントロール的なIgG2a、。。3アイソタイプコントロールIgG1を、4 CD45、5 CD54、。。6 CD90 1細胞のみ）6つのラベルの付いた試験管に分注し100μlの細胞懸濁液。
3. （：;：0.5μg百万分の一の細胞、CD54：0.25μg百万分の一の細胞、CD90：CD4520μlの百万分の一の細胞IgG2aおよびIgG1の0.15μg百万分の一の細胞）を適切な濃度でアイソタイプコントロールおよび一次抗体を追加して4℃でインキュベートする30分。
4. 二回して、100μlの細胞の染色バッファーで細胞を再懸1X D - PBSで細胞を洗浄する。 SA - PE（ストレプトアビジン - フィコエリスリン、百万個の細胞あたり0.15μgを使用）を追加し、4℃でインキュベートCの暗所で30分間。
5. 倍1X D - PBSで標識した細胞を洗う。 400μlの細胞の染色バッファーで細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー分析のためにファルコンチューブに移す。

4。 MSCを派生シングルコロニーの分離

MSCは、異なるセルの形状、成長率だけでなく、分化能⁶の異なる亜集団から構成される不均一な集団である。しかし、すべての亜集団は、既知のMSCマーカーを発現し、従ってそれはこれらの亜集団を分離するためのマーカーを使用することは不可能です。したがって、我々は単一細胞によって形成されたコロニーな異なる亜集団を、分離するクローニングシリンダーを適用する。

1. 10 cmディッシュあたり約50〜100個の細胞で細胞を​​プレート。 1〜2週間で37℃、5％CO ₂インキュベーター中でインキュベートする。この期間中、倒立顕微鏡でよく分離したコロニーを調べる。コロニーが十分に大きいサイズを（より各コロニーにおける100以上の細胞）に到達したら、皿の底にあるシャーピーとコロニーをマーク。マークされるコロニーを選択するときに、厳選されたGoogle Earthでも周囲のコロニーがないことを確認してください。
2. 培地を吸引し、1XのD - PBSで一度皿を洗う。滅菌ピンセットで滅菌クローニングシリンダーをピックアップし、優しく著しいコロニーの周りに置きます。すべてのマークされたコロニーは、上に配置、クローニングシリンダーになるまでこれを繰り返します。選んだコロニーは遠く離れてお互いからすべてのクロー​​ニングシリンダーが1つしかコロニーが含まれているようなものであるべきである。
3. 各クローニングシリンダーに100μlのトリプシン- EDTAを追加し、約5分間インキュベーターに皿を戻す。 5分後、彼らは切り上げかどうかを確認するために顕微鏡下で細胞を確認してください。細胞が持ち上げているときは、トリプシンを不活化するために培養液の同量を追加します。 200μlのマイクロピペッタで細胞懸濁液を混和し、3ミリリットル温めておいた培地を含む60ミリメートルディッシュに細胞懸濁液を移す。適切に皿にラベルを付け、インキュベーターにそれらを戻す。これから数日間にわたって形態学的変化を追跡。

5。代表的な結果

ラットMSCの分離のための部分で説明されているプロトコルによると、プラスチックの接着MSCは、めっき後の翌日に見えるはずです。細胞が増殖し続けているため、コンフルエントな細胞は、図1Aに示すように細胞のようになります。細胞がコンフルエント〜80％（図1B）に到達すると、継代培養を行うことができる。サブカルチャーの間に、トリプシン- EDTAは、細胞と持ち上げ細胞を分離するために使用され、図1Cに示すように小さくし、丸いです。

図1。ラットMSCの位相コントラスト像 。 （A）コンフルエントのMSC。細胞の大多数は、紡錘状または星状です。 （B）のMSC約80％コンフルエント。 （C）トリプシン処理後の細胞は小さく、丸い浮き。

一度のMSCは、フローサイトメトリー分析は表面マーカーの式を検証するために行われる、磁気細胞ソーティングによって濃縮される。濃縮が良ければ、細胞はHSCマーカーCD45（図2）に対してMSCマーカーCD54とCD90が陰性に対して陽性染色を示す必要があります。アイソタイプコントロールIgG2aおよびIgG1を陰性コントロールとして使用されています。

図2。表面マーカーのためのMSCのフローサイトメトリー分析。MSCはIgG2aの（アイソタイプコントロール1）、IgG1の（アイソタイプコントロール2）、CD45、CD54およびCD90に対する抗体で標識した。 MSCはCD54とCD90ではなくCD45を表明した。

細胞は適切なクローン密度で播種されると、コロニーは単一の細胞から立ち上がる必要があります。図3Aは、単一のセルによって形成されたコロニーを表します。クローニングシリンダーは、別々に培養することができるコロニー由来するコロニーと細胞を分離するために使用することができます。図3Bおよび3Cは、2つの個々のコロニーに由来する細胞を表しています。コロニー1から由来する細胞は、コロニー2由来の細胞のに対し（図3B）のようなスピンドルですラウンド（図3C）です。

図3。 MSCおよび単一コロニー由来の細胞によるコロニー形成。MSCは、クローン密度のフォームの個々のコロニーで培養。これらのコロニーは別々に培養することができるクローニングシリンダーと異なるコロニー由来の細胞で区切ることができます。クローン密度で播種したとき（A）代表的なコロニーは、MSCによって形成。 （B）1つのコロニーに由来する細胞を紡錘状。 （C）円形細胞が別のコロニーから派生。

Discussion

このプロトコルは、分離してMSCを豊かにする方法について説明します。シングルコロニー由来の細胞を分離する方法も組み込まれています。成功した分離、濃縮とコロニー分離する際に重要となるいくつかのステップがあります。ラットからの細胞単離を行っている間、それは、セルストレーナーまたは血液凝固と骨の破片を取り除くために同じようなサイズの滅菌ナイロンメッシュを介してフィルタリングすることをお勧めします。一晩細胞を播種した後、多くの死んだ細胞が培地中にフローティングされ、死んだ細胞は接着細胞の成長を支援すべき新鮮な培地と置換することによって除去される。

このプロトコルでソート磁気セルは、正の選択を実行する方法について説明し、同様の手続きが負の選択を実行するために使用することができます。追加される抗体の量が異なる場合がありますし、最適化は、より良いソートを達成するために要求されます。これは、フローサイトメトリー分析のために細胞を標識する場合も同様です。すぐに標識サンプルのフローサイトメトリー分析を実行していない場合、サンプルは2％ホルムアルデヒドで固定し、後で実行することができます。これは自家蛍光と犠牲のサンプルの品質を向上させる傾向があるため、しかし、長期保存は推奨されません。

コロニーの分離のための重要な部分は、右の細胞密度で播種（実験的に最適化されるべき）と、他のクローンに囲まれていない単一のクローンの場所です。他のクローンが近くにある場合は、クローニングシリンダー近くのクローンを包含することができ、得られた細胞は、もはや一つのクローンからできなくなります。クローンoverクローニングシリンダーを配置する際、また、これはセルをカバーし、それらを切り離すために細胞を達することからトリプシンを防ぐために、クローニングシリンダーの下部にシリコングリスを原因となるので、皿の表面の上にスライドしないように注意してください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X D-PBS	Invitrogen	14040-133
DMEM	Invitrogen	11885-084
Cell strainer	BD Biosciences	352350
FBS	Invitrogen	26140-079
Pen-Strep	Invitrogen	15140
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
BD Imagnet	BD Biosciences	552311
Biotin mouse IgG2a	BD Biosciences	555572
Biotin mouse IgG1	BD Biosciences	555747
Biotin anti-rat CD54	Cedarlane Labs	CL054B
Biotin anti-rat CD90	Cedarlane Labs	CL005B
Biotin anti-rat CD45	Cedarlane Labs	CL001B
BD Imag buffer	BD Biosciences	552362
Round-bottom tube	BD Biosciences	352063
Streptavidin particles	BD Biosciences	557812
SA-PE	R&D Systems	F0040
Cloning cylinder	Sigma-Aldrich	C2059