Summary
Assay זה מעריך את היכולת של מולקולות איתות, עצם פה חלבון המוךפו"גנטי שהולך 7 (BMP7), לארגון מחדש של אקסונים commissural. Explant של חוט השדרה הגבי העובריים בתרבית הסמוכים המצרפי של הפרשת התאים COS הצמיחה גורמים מועמד. אקסונים commissural ההתמצאות גדל בתוך explant הם דמיינו ידי אימונוהיסטוכימיה.
Abstract
אקסונים commissural הגבי בעמוד השדרה חוליות 1 כבר מערכת מודל יסולא בפז שבו כדי לזהות אותות הדרכה האקסון. כאן אנו מתארים ב assay חוץ גופית, "assay ארגון מחדש", כי כבר נעשה שימוש נרחב כדי לחקור את ההשפעה של אותות החיצונית והרמה הפנימית על האוריינטציה של אקסונים commissural 2. Assay זו פותחה על ידי אנשים רבים במעבדות של ג'יין דוד, תומאס Jessell ואנדרו לומסדן (ראה התודות לפרטים נוספים) וגירסאות של assay זה שימשו כדי להדגים את פעולות ארגון מחדש של מולקולות הנחיה מפתח האקסון, כולל BMP chemorepellent ב הגג צלחת 3,4 ופעילות chemoattractive של Netrin1 5 ו סוניק הקיפוד (ששש) 6 בצלחת הרצפה בחוט השדרה.
Explants הכולל 2-3 שכבות הגבי שני שלישים של עמוד השדרה הם גזור מיום עובריים (E) 11 חולדות תרבותי בשלוש ג'ל קולגן ממדי 7. Explants E11 השדרה הגבי מכילים נוירונים commissural שזה עתה נולד, אשר ניתן לזהות על ידי ביטוי axonal שלהם גליקופרוטאין, Tag1 8. במהלך 30-40 שעות בתרבות, מסלול האקסון commissural הוא סיכם אלה explants הגב עם כמובן זמן דומה לזה ראיתי in vivo. מסלול זה axonal ניתן לערער על ידי הצבת או רקמות מבחן או במצטבר תא COS להביע מולקולה מועמד איתות במגע עם אחד הקצוות לרוחב של explant הגבי. אקסונים Commissural הארכת באזור של רקמת צירף יגדל תחת השפעת הצלחת שני גג אנדוגני אותות מן הרקמה לרוחב חוץ רחמי. המידה שבה הם אקסונים commissural ההתמצאות בנסיבות אלו ניתן לכמת. שימוש assay זה, אפשר גם לבחון את ההסתפקות של אות מסוים לארגון מחדש של אקסונים commissural 3,4 כמו גם הצורך לאות זה לכוון את מסלול commissural 9.
Protocol
חלק 1: הכנת מצרפי של תאים transfected COS באמצעות טיפות תליה
- זרעים COS-7 (COS) תאים בצלחות תרבות 35mm. כאשר הם מגיעים 80% confluency, 1μg transfect הביטוי הפלסמיד לתוך התאים באמצעות Lipofectamine2000 לפי הפרוטוקול של היצרן.
- כדי להכין תלוי טיפות, לשאוב את המדיום transfection ולשטוף את התאים COS transfected עם פוספט 1ml של 1x פתרון שנאגרו (PBS). התייחס תאים עם 0.5ml של המדיום האנזים ללא תא דיסוציאציה במשך 15 דקות. הוסף 1ml של תמיסה של Opti-ממ סרום + 1x פניצילין / סטרפטומיצין / גלוטמין (P / S / G) 10% + שור עוברית (FBS) כדי לעצור את התגובה.
- Triturate התאים כדי להסיר אותם מפני השטח של צלחת התרבות להעביר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. ספין 2 דקות ב 2000k ל גלולה התאים. הסר supernatant ו resuspend גלולה ב 100μl של Opti-1x ממ + P / S / G + 10% FBS.
- ספוט טיפות 20μl מרובים על החלק הפנימי של מכסה תרבות 35mm צלחת, להפוך המכסה ומניחים על גבי החלק התחתון של צלחת ולהשאיר בתוך 37 ° C בחממה במשך כמה שעות עד התאים מצטברים.
חלק 2: הכנת Explants עמוד השדרה הגבי
- לנתח עוברים E11 חולדה מן הרחם של האם לשמור על הקרח במדיום L15 עד הצורך.
- עם מחט טונגסטן חידד, להסיר סעיף 4-6 קטע מתא המטען של העובר כל מהאזור מיד מתחת forelimb ניצן. בעזרת פיפטה פלסטיק, לאסוף את פיסות רקמה אחת גם מנה 4-באר Nunc ולשמור על הקרח.
- כאשר כל חלקי העובר כבר גזור, השתמש פיפטה פלסטיק להעביר את חתיכות לתוך תמיסה של 1ml L15 + 1mg dispase שנייה גם של המנה Nunc. דגירה בטמפרטורת החדר למשך לא יותר מ 5 דקות. אל על דגירה חלקי רקמה עם dispase.
- במהלך הדגירה, הוסף 0.5ml של חום עז מומת בסרום נורמלי (וההיגז) עד 10 מ"ל של כ L15 לתוך צלחת פטרי מערבולת לערבב. העברת 1ml של פתרון זה לתוך 1 / 3 גם של המנה Nunc ולהעביר את חתיכות רקמה לתוך פתרון זה כאשר הדגירה נגמר. שמור על הקרח. הערה: לנתיחה שלאחר מכן יהיה קל יותר אם חתיכות רקמה מותר "לנוח" על קרח למשך שעה.
חלק 3: קולגן תחול
- הוסף בינוני 40μl 10x Essential מינימלית קולגן 360μl, לערבב במהירות וביסודיות על ידי מצליף או בקצרה vortexing את הצינורית. ספין למטה במהירות picofuge. הפתרון יהיה צהוב. שמור על הקרח כמה שיותר.
- הוסף מספיק סודיום ביקרבונט 0.8M (NaHCO 3) להפוך את פתרון קולגן כתום מעט (ראה הערה להלן). שוב, לערבב במהירות וביסודיות על ידי מצליף, ואת ספין למטה בקצרה picofuge. אם הפתרון נשאר ורוד לאחר ערבוב, שהוספת NaHCO 3 יותר מדי ויהיה צריך להתחיל שוב עם צינור חדש של קולגן.
- בשלב זה הפתרון קולגן הוא דרוך. זה יישאר נוזלי על הקרח, אבל יהיה לגבש בתוך כ -5 דקות (גוון ורוד) כאשר הביאו לטמפרטורת החדר.
- ספוט 20μl של קולגן היטב כל מנה 4-באר Nunc. באמצעות קצה פיפטה שלך, להפיץ את הקולגן להקים "כרית" קטנה. תן קולגן להגדיר בטמפרטורת החדר.
הערה: הכמות המדויקת של NaHCO 3 יהיה צורך טיטרציה עבור כל אצווה של קולגן. התחל נמוכה (11μl) ולאחר מכן להוסיף 0.5-1μl בשלבים עד הפתרון הוא גוון קל של כתום. הסכום "הנכון" הוא בדרך כלל 1ul פחות מהסכום הקטן ביותר של NaHCO 3 שיהפוך הוורוד קולגן. כמות NaHCO 3 לא בקנה מידה ליניארי למעלה או למטה.
חלק 4: Dissection של הגב Explants חוט השדרה מיצוב מהם עם מצרפי COS תא קולגן מטריקס
- באמצעות מחט טונגסטן חידד טרי וזוג מלקחיים קנס (# 5 או # 55), להסיר את והמזודרם שסביב לחוט השדרה.
- חיתוך במקביל צלחת על הרצפה עם המחט טונגסטן, להסיר בזהירות החמישי הגחון של חוט השדרה.
- החוצים את השדרה הגבי explant, ולוודא כי הקצוות נחתכים כמו נקי ככל האפשר. Re-לקצץ את הקצוות, במידת הצורך. העברת כל explant השדרה הגבי על כריות קולגן נפרדים באמצעות פיפטה בפה מצויד עם שפופרת זכוכית נימי משך כ. 0.5mm קוטר.
- חותכים את המצרפי של תאים COS transfected לריבועים של רוחב כ זהה לקצה הלטרלי של explant השדרה הגבי.
- העברת באחד הריבועים האלה על כרית עם קולגן explant השדרה הגבי, בעזרת פיפטה בפה.
- בעזרת פיפטה בפה, לשאוב את כל הנוזל העודף באמצעות פיפטה בפה. אל על לשאוב.
- החל 4μl של קולגן דרוך על כרית, וכן, באמצעות מחט הטונגסטן, הזז את הקולגן על explants מבלי לגעת ישירות רקמות. על ידי הזזת המחט טונגסטן ב קולגן סביב explants, המזרח explants כך מצטברים בתאי COS צמוד לקצה הלטרלי של explant השדרה הגבי.
- לאחר הקולגן קבע, לחזור את היישום של 4μl של קולגן על מנת להבטיח כי explants נארזים לחלוטין קולגן.
- במנדף בתרבית רקמה, להוסיף 0.5ml של 1xP/S/G + Opti-ממ ותרבות שעות 30-40.
- תקן explants במשך 45 דקות עם 4% paraformaldehyde 0.5ml ב 1xPBS, שמירה על צלחת על הקרח.
- שטפו פעמיים עם 0.5ml של פתרון חסימת 1xPBS + 0.1% Triton-X100 וההיגז 1% (PBTN). בלוק על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שעות לפחות, דגירה לילה עדיפה ואז התהליך אימונוהיסטוכימיה.
חלק 5: ויזואליזציה של אקסונים Commissural ידי אימונוהיסטוכימיה
- לאחר חסימת PBTN, לחתוך את explants מתוך צלחת 4 היטב עם מלקחיים ומניחים בצלחת 48-באר.
- הוסף 200μl של נוגדנים ראשוני זה טוב להשאיר לילה בשעה 4 ° C. כדי להמחיש אקסונים commissural, להשתמש בפתרון 01:06 של נוגדנים נגד Tag1 העכבר. כדי לקבוע אם transfection בוצעה בהצלחה, כוללים גם נוגדן כנגד העיקרי או מולקולת האיתות למבחן, או epitope רלוונטי אם מולקולת האיתות כבר epitope מתויג.
- לשטוף כל מדגם לשעה 5 1 x ב PBTN ב 4 ° C.
- הוסף 200μl של נוגדנים משני זה טוב להשאיר לילה בשעה 4 ° C. אם אנטי Tag1 נוגדנים שימשו הנוגדן העיקרי, להשתמש בעכבר נגד עז IgM נוגדנים משני מצמידים או FITC או Cy3. אם באמצעות אור רגישים משני הנוגדנים מצמידים את FITC או Cy3, לשמור את המנה 48-מכוסה היטב בנייר כסף מנקודה זו ואילך.
- לשטוף כל מדגם 5 x 1 שעה כל PBTN ב 4 ° C.
- העברת explant להחליק 3-באר דיכאון, להסיר את נוזל עודף, הר ב Vectashield בינוני coverslip. חנות בתיבת בטוח אור או 4 ° C או -20 ° C.
חלק 6: תמונות נציג Explants
בניסוי מוצלח, explant ו המצרפי COS יישאר הסמוכים זה לזה ולא מתרחקים זה מזה כמו קולגן קובע. יהיו יתר מינימלית של אקסונים; יתר axonal משמעותי מצביע על כך explant השדרה הגבי היה מתורבת יותר מדי זמן. לא יהיה blebs הגוברת מצד explant; blebbing מתרחשת כאשר הרקמה בא במגע ישיר עם המדיום לתרבות.
היכולת של מולקולת איתות לארגון מחדש של אקסונים הוא הוערכה באמצעות מיקרוסקופיה confocal. היקף של ארגון מחדש האקסון ניתן לכמת על ידי מדידת זווית ממוצעת של ארגון מחדש של אקסונים הקרובים במצטבר תא COS 3. כפי שניתן לראות בתרשים 1, תאים COS להביע myc-tagged BMP7 (כחול) לארגון מחדש של אקסונים commissural Tag1 + (ירוק) הרחק ממקור BMP7 (איור 1B) בדומה לאופן שבו explant צלחת גג דוחה אקסונים commissural (איור 1A). תאים COS להביע וקטור השליטה אין השפעה על הכיוון של אקסונים commissural 3,4. Explants אלה כונו גם עם נוגדנים נגד גורם שעתוק Isl1 / 2 (אדום), אשר מעטר הנוירונים המוטוריים interneurons הגבי. תוצאה זו היתה הסימן הראשון כי חבר של המשפחה BMP מתווכת את הפעילות של 3 הגג צלחת chemorepellent.
איור 1: אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
גורמים קריטיים הקובעים הצלחה בביצוע הזה assay הם הראשון, רקמות לא צריכים להיות מטופלים עם dispase לתקופה ממושכת מדי, טיפול כזה יביא הרקמה להיות דביק מאוד לאחר ירידה הכדאיות. שני, קולגן חייב להיות דרוך לחלוטין ושמר על הקרח כמה שיותר. זה יהיה קשה יותר ויותר להתמודד אם זה מתחיל לשקוע, כלומר להפוך ורוד. שלישית, המחט טונגסטן חייב תמיד להיות כל הזמן מאוד חדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
פרוטוקול זה פותח במעבדות של ג'יין דוד, תומאס Jessell ואנדרו לומסדן. אנשים רבים, כולל קונרד Basler, אן Calof, תומאס Edlund, פיל המילטון, Domna Karagogeos, אריאל רואיז אני Altaba ו Toshiya יאמאדה נקבע כיצד explants תרבות של חוט השדרה של קולגן. מרישה Placzek ומארק טסייה-לאבין חלוץ בטכניקה של צמיחה באמצעות האקסון מ ב explants במבחנה כאמצעי זיהוי מולקולות הנחיה האקסון. עבודה במעבדה באטלר נתמך על ידי תרומות של מצעד הפרוטות ו R01 NS063999 מ-NIH / NINDS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 1 rat tail collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| 10x Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11430-030 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 51985-034 | |
| L15 | Invitrogen | 11415-064 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1166-8019 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech, Inc. | 35-016-CV | |
| Cell dissociation solution | EMD Millipore | S-004-C | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Invitrogen | 2520-0056 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Pen/Strep/Glutamate | Invitrogen | 10378-016 | |
| Paraformaldhyde | Baker/VWR | JTS898-7 | |
| Dispase | Roche Group | 10241750001 | |
| mouse anti Tag1 IgM (4D7) | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| mouse anti Myc IgG (9E10) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-40 | |
| goat anti mouse IgM FITC | Jackson | 115-095-075 | |
| goat anti mouse Fcy Cy3 | Jackson | 115-165-071 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210064 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 4 well Nunclon dish | Nalge Nunc international | 62407-068 | |
| 3 well depression slide | VWR international | 48339-009 | |
| 48 well dish | Falcon BD | 62406-195 | |
| Aspirator tuve assembly | FHC, Inc. | 30-32-0 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| #5 Dumont forcept | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 26016-12 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
- Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
- Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
- Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Dodd, J., Morton, S. B. Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons. Neuron. 1, 105-116 (1988).
- Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).
