Summary
Questo test valuta la capacità di una molecola di segnalazione, qui proteina morfogenetica dell'osso 7 (BMP7), di riorientare gli assoni commissurali. Un espianto di midollo embrionale dorsale spinale è colta adiacente a un aggregato di cellule secernenti COS i fattori di crescita candidato. Riorientato assoni commissurali crescita all'interno del espianto sono visualizzati mediante immunoistochimica.
Abstract
Dorsale commissurali assoni nel midollo spinale dei vertebrati 1 sono stati di un sistema prezioso modello in cui identificare i segnali di guida degli assoni. Qui, descriviamo un test in vitro ", il saggio riorientamento", che è stato ampiamente utilizzato per studiare l'effetto dei segnali estrinseci ed intrinseci sull'orientamento degli assoni commissurali 2. Questo test è stato sviluppato da numerose persone nei laboratori di Jane Dodd, Thomas Jessell e Andrew Lumsden (si vedano i ringraziamenti per maggiori dettagli) e le versioni di questo test sono stati utilizzati per dimostrare l'attività di riorientamento delle molecole chiave di guida degli assoni, tra cui il chemorepellent in BMP tetto piatto 3,4 e le attività di chemoattractive Netrin1 5 e Sonic hedgehog (Shh) 6 in la lastra di fondo nel midollo spinale.
Espianti composto da 2-3 segmenti della dorsale due terzi del midollo spinale vengono sezionati fin dal primo giorno embrionale (E) 11 ratti e coltivate in tre gel collagene dimensionale 7. E11 espianti dorsale spinale contengono neonata commissurali neuroni, che possono essere identificati dal loro espressione della glicoproteina assonale, Tag1 8. Nel corso di 30-40 ore nella cultura, la traiettoria assone commissurali è riassunta in queste espianti dorsale con un decorso simile a quello visto in vivo. Questa traiettoria assonale può essere contestata o posizionando i tessuti di prova o un aggregato di cellule COS esprimono una molecola di segnalazione candidato in contatto con uno dei bordi laterali del espianto dorsale. Assoni commissurali si estende in prossimità del tessuto aggiunto crescerà sotto l'influenza sia della lamiera del tetto endogeno e segnali del tessuto ectopico laterale. Il grado con cui sono riorientato assoni commissurali in queste circostanze può essere quantificato. Da questo test, è possibile sia per esaminare la sufficienza di un segnale particolare di riorientare gli assoni commissurali 3,4 come pure la necessità di questo segnale per dirigere la traiettoria commissurali 9.
Protocol
Parte 1: Preparazione di aggregati di cellule COS transfettati con gocce
- COS-7 di semi (COS), le cellule in capsule di Petri da 35 mm. Quando raggiungono l'80% confluenza, 1μg trasfezione del plasmide di espressione nelle cellule utilizzando Lipofectamine2000 secondo il protocollo del produttore s.
- Per preparare appeso gocce, aspirare il terreno di trasfezione e risciacquare le cellule COS transfettate con 1 ml di soluzione tamponata 1x fosfato (PBS). Il trattamento di cellule con 0,5 ml di medio enzima cellulare senza dissociazione per 15 minuti. Aggiungere 1 ml di una soluzione di Opti-MEM + 1x Penicillina / Streptomicina / Glutammina (P / S / G) + 10% siero fetale bovino (FBS) per arrestare la reazione.
- Triturare le cellule per rimuoverli dalla superficie del piatto cultura e trasferire in una provetta da 15 ml conica. Spin per 2 minuti a 2000K per agglomerare le cellule. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 100μl di Opti-MEM + 1x P / S / G + 10% FBS.
- Spot più gocce 20μl all'interno di un coperchio piatto 35 millimetri cultura, capovolgere il coperchio e posto in cima al fondo del piatto e lasciare in un incubatore a 37 ° C per diverse ore fino a quando le cellule aggregato.
Parte 2: Preparazione del midollo spinale dorsale Espianti
- Sezionare embrioni di ratto E11 dall'utero della madre e tenere sul ghiaccio in L15 medio fino a quando necessario.
- Con un ago di tungsteno affilato, rimuovere una sezione 4-6 segmento dal tronco di ogni embrione, dalla regione immediatamente al di sotto degli arti anteriori gemma. Utilizzando una pipetta di plastica, raccogliere i pezzi di tessuto in un pozzetto di un 4-Nunc ben piatto e tenere in ghiaccio.
- Quando tutti i segmenti embrione sono stati sezionati, utilizzare la pipetta di plastica per trasferire i pezzi in una soluzione di 1ml L15 + 1mg dispasi in un secondo pozzo del piatto Nunc. Incubare a temperatura ambiente per non più di 5 minuti. Non più di incubare i pezzi di tessuto con dispasi.
- Durante l'incubazione, aggiungere 0,5 ml di siero inattivato con il calore di capra normale (HIGS) a circa 10 ml di L15 in una piastra di Petri e mescolare. Trasferire 1 ml di questa soluzione in un terzo pozzo del piatto Nunc e trasferire i pezzi di tessuto in questa soluzione quando l'incubazione è finita. Tenere su ghiaccio. Nota: la dissezione successiva sarà più facile se i pezzi di tessuto sono autorizzati a "riposo" in ghiaccio per un'ora.
Parte 3: Collagene Priming
- Aggiungere 40μl 10x terreno minimo essenziale al collagene 360μl, mescolare rapidamente e accuratamente sfogliando o brevemente il tubo vortex. Spin down rapidamente in un picofuge. La soluzione sarà giallo. Tenere sul ghiaccio il più possibile.
- Aggiungere abbastanza bicarbonato di sodio 0,8 M (NaHCO 3) per trasformare la soluzione collagene leggermente arancione (vedi nota sotto). Ancora una volta, mescolare rapidamente e accuratamente sfogliando, e spin down brevemente in una picofuge. Se la soluzione rimane rosa dopo la miscelazione, aver aggiunto troppo NaHCO 3 e sarà necessario ricominciare da capo con un tubo fresco di collagene.
- A questo punto la soluzione di collagene è innescato. Rimarrà liquido sul ghiaccio, ma si solidificano in circa 5 minuti (girando rosa) quando portati a temperatura ambiente.
- 20μl posto del collagene in ciascun pozzetto di una 4-ben piatto Nunc. Utilizzando la punta della pipetta, si sviluppa il collagene per formare una piccola "pad". Lasciate che il collagene fissato a temperatura ambiente.
Nota: la quantità esatta di NaHCO 3 dovranno essere titolati per ogni lotto di collagene. Inizio bassa (11μl) e quindi aggiungere 0,5-1ml gradualmente fino a quando la soluzione è una tonalità leggermente di arancio. La quantità "giusta" è di solito 1UL inferiore alla più piccola quantità di NaHCO 3, che farebbe diventare la rosa collagene. La quantità di NaHCO 3 non scala linearmente su o giù.
Parte 4: Dissezione di dorsali Espianti midollo spinale e posizionamento di loro con aggregati di cellule COS in Collagen Matrix
- Utilizzando un ago di tungsteno appena affilato e un paio di pinze multa (# 5 o # 55), rimuovere il mesoderma che circonda il midollo spinale.
- Taglio parallelo al pianale con l'ago di tungsteno, rimuovere con attenzione il quinto ventrale del midollo spinale.
- Bisecare l'espianto dorsale della colonna vertebrale, assicurandosi che i bordi sono tagliati in modo pulito possibile. Ri-tagliare i bordi, se necessario. Trasferimento ogni espianto dorsale spinale sul pad collagene separati utilizzando una pipetta a bocca dotata di un tubo capillare di vetro tirato a ca. 0,5 millimetri di diametro.
- Tagliare l'aggregato di cellule COS transfettate in quadrati di circa la stessa larghezza del bordo laterale del espianto dorsale della colonna vertebrale.
- Trasferire una di queste piazze sul pad collagene con l'espianto dorsale della colonna vertebrale, utilizzando una pipetta a bocca.
- Con la pipetta bocca, aspirare via il liquido in eccesso con la pipetta bocca. Non più di aspirare.
- Applicare 4μl di collagene innescato sul pad, e, utilizzando l'ago di tungsteno, Spostare il collagene negli espianti senza toccare direttamente il tessuto. Spostando l'ago di tungsteno nel collagene che circonda la espianti, orientare il espianti in modo che l'aggregato cellule COS è adiacente al bordo laterale della espianto dorsale della colonna vertebrale.
- Dopo che il collagene è impostato, ripetere l'applicazione di 4μl di collagene per assicurare che il espianti sono completamente racchiusi in collagene.
- In una cappa colture di tessuti, aggiungere 0,5 ml di Opti-MEM 1xP/S/G + e cultura per 30-40 ore.
- Fix espianti per 45 minuti con 0,5 ml paraformaldeide 4% in 1xPBS, mantenendo la piastra sul ghiaccio.
- Lavare due volte con 0,5 ml di una soluzione di blocco dei 1xPBS + 0,1% Triton-X100 HIGS +1% (PBTN). Blocco a 4 ° C per almeno un paio d'ore, una notte di incubazione è preferibile e quindi elaborare mediante immunoistochimica.
Parte 5: Visualizzazione di assoni commissurali di Immunoistochimica
- Dopo aver bloccato in PBTN, tagliare i espianti dalla piastra ben 4 con una pinza e mettere in un piatto ben 48.
- Aggiungere 200μl di anticorpi primari in ogni pozzetto e lasciare per una notte a 4 ° C. Per visualizzare gli assoni commissurali, utilizzare una soluzione 1:06 di topo anti-Tag1 anticorpi. Per determinare se la transfezione è riuscita, anche un anticorpo primario contro sia la molecola di segnalazione in fase di test, o l'epitopo rilevante se la molecola di segnalazione è stato epitopo tag.
- Lavare ogni campione per 5 x 1 ora in PBTN a 4 ° C.
- Aggiungere 200μl di anticorpo secondario in ogni pozzetto e lasciare per una notte a 4 ° C. Se gli anticorpi anti-Tag1 sono state usate come l'anticorpo primario, utilizzare un anti capra anticorpi IgM secondario del mouse abbinato a uno o FITC Cy3. Se si utilizza la luce anticorpi sensibili secondario accoppiato al FITC o Cy3, tenere il 48 e piatto coperto in fogli da questo punto in poi.
- Lavare ogni campione di 5 x 1 ora ciascuna a PBTN a 4 ° C.
- Trasferimento espianto di un 3-scivolo e depressione, rimuovere il liquido in eccesso, montare in Vectashield medio e coprioggetto. Conservare in una scatola luminosa di sicurezza sia a 4 ° C o -20 ° C.
Parte 6: immagini rappresentative di espianti
In un esperimento riuscito, l'espianto e aggregati COS rimarrà adiacenti l'uno all'altro e non allontanarsi, come il collagene set. Non ci sarà crescita eccessiva minima degli assoni; significativa crescita eccessiva assonale indica che l'espianto dorsale della colonna vertebrale è stata colta per troppo tempo. Non ci saranno blebs crescente l'espianto; blebbing si verifica se il tessuto viene a contatto diretto con il terreno di coltura.
La capacità della molecola di segnalazione di riorientare assoni viene valutato usando la microscopia confocale. Il grado di riorientamento assone può essere quantificata misurando l'angolo medio di riorientamento degli assoni più vicino al aggregato di cellule COS 3. Come mostrato nella Figura 1, le cellule che esprimono COS myc-tag BMP7 (blu) riorientare Tag1 + assoni commissurali (verde) di distanza dalla fonte di BMP7 (Figura 1B) simile al modo in cui un espianto di lamiera del tetto respinge assoni commissurali (Figura 1A). COS cellule che esprimono un vettore di controllo non hanno alcun effetto sull'orientamento degli assoni commissurali 3,4. Questi espianti sono stati etichettati con anticorpi contro il fattore di trascrizione Isl1 / 2 (rosso), che decora i motoneuroni e interneuroni dorsale. Questo risultato è stato il primo segnale che un membro della famiglia della media BMP l'attività dei 3 lamiera del tetto chemorepellent.
Figura 1: Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 1.
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Discussion
I fattori critici che determinano il successo nello svolgimento di questo saggio sono prima, il tessuto non devono essere trattati con dispasi per un periodo troppo prolungato, tale trattamento sarà seguito nel tessuto diventando molto appiccicosa e con ridotta capacità di sopravvivenza. Due, il collagene deve essere perfettamente innescato e tenuta in ghiaccio il più possibile. Diventerà sempre più difficile da gestire se inizia a impostare, ad esempio si tingono di rosa. Tre, l'ago di tungsteno deve essere sempre mantenuta molto forte.
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Acknowledgments
Questo protocollo è stato sviluppato nei laboratori di Jane Dodd, Thomas Jessell e Andrew Lumsden. Molte persone, tra cui Konrad Basler, Ann Calof, Thomas Edlund, Phil Hamilton, Domna Karagogeos, Ariel Ruiz i Altaba e Toshiya Yamada determinato come espianti cultura del midollo spinale nel collagene. Marysia Placzek e Marc Tessier-Lavigne sperimentato la tecnica di usare la crescita degli assoni da espianti in vitro come mezzo per identificare molecole di guida degli assoni. Lavoro in laboratorio Butler è sostenuto da finanziamenti della March of Dimes e R01 NS063999 dal NIH / NINDS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 1 rat tail collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| 10x Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11430-030 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 51985-034 | |
| L15 | Invitrogen | 11415-064 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1166-8019 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech, Inc. | 35-016-CV | |
| Cell dissociation solution | EMD Millipore | S-004-C | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Invitrogen | 2520-0056 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Pen/Strep/Glutamate | Invitrogen | 10378-016 | |
| Paraformaldhyde | Baker/VWR | JTS898-7 | |
| Dispase | Roche Group | 10241750001 | |
| mouse anti Tag1 IgM (4D7) | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| mouse anti Myc IgG (9E10) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-40 | |
| goat anti mouse IgM FITC | Jackson | 115-095-075 | |
| goat anti mouse Fcy Cy3 | Jackson | 115-165-071 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210064 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 4 well Nunclon dish | Nalge Nunc international | 62407-068 | |
| 3 well depression slide | VWR international | 48339-009 | |
| 48 well dish | Falcon BD | 62406-195 | |
| Aspirator tuve assembly | FHC, Inc. | 30-32-0 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| #5 Dumont forcept | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 26016-12 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
- Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
- Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
- Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Dodd, J., Morton, S. B. Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons. Neuron. 1, 105-116 (1988).
- Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).
