Summary
इस परख संकेत अणु की क्षमता, यहाँ अस्थि Morphogenetic 7 प्रोटीन (BMP7), commissural axons नई दिशा का आकलन. भ्रूण पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी का एक explant COS कोशिकाओं स्रावित उम्मीदवार वृद्धि कारकों की कुल करने के लिए आसन्न सुसंस्कृत है. पुनर्भिविन्यासित commissural explant के भीतर बढ़ रही axons immunohistochemistry द्वारा कल्पना कर रहे हैं.
Abstract
हड्डीवाला रीढ़ की हड्डी में 1 पृष्ठीय commissural axons एक अमूल्य मॉडल प्रणाली है जिसमें अक्षतंतु मार्गदर्शन संकेतों की पहचान करने के लिए किया गया है. यहाँ, हम इन विट्रो परख, "पुनरभिविन्यास परख", कि बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है commissural axons के उन्मुखीकरण 2 पर बाह्य और आंतरिक संकेतों के प्रभाव का अध्ययन में एक वर्णन. इस परख जेन डोड, थॉमस Jessell और एंड्रयू Lumsden की प्रयोगशालाओं में कई लोगों द्वारा विकसित किया गया था (अधिक जानकारी के लिए acknowledgments देखें) और इस परख के संस्करणों के लिए कुंजी अक्षतंतु मार्गदर्शन अणुओं के पुनरभिविन्यास गतिविधियों का प्रदर्शन किया गया chemorepellent बीएमपी में सहित, छत प्लेट 3,4 और 5 Netrin1 और ध्वनि (श्श्श) हाथी रीढ़ की हड्डी में फर्श की थाली में 6 के chemoattractive गतिविधियों .
पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी के दो तिहाई के 2-3 खंडों शामिल Explants भ्रूण (ई) दिन 11 चूहों से विच्छेदित कर रहे हैं और तीन आयामी कोलेजन 7 जैल में सभ्य. E11 पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी explants नव जन्म commissural न्यूरॉन्स, जो उनके ग्लाइकोप्रोटीन, 8 tag1 axonal अभिव्यक्ति के द्वारा पहचाना जा सकता है है होते हैं. संस्कृति में 30-40 घंटे के दौरान, commissural अक्षतंतु प्रक्षेपवक्र vivo में देखा है कि इसी तरह एक बार कोर्स के साथ इन पृष्ठीय explants में recapitulated है. यह axonal प्रक्षेपवक्र या तो परीक्षण ऊतकों या COS सेल पृष्ठीय explant के पार्श्व किनारों के साथ संपर्क में एक उम्मीदवार संकेत अणु व्यक्त कुल रखकर चुनौती दी जा सकती है. Commissural संलग्न ऊतक के आसपास के क्षेत्र में विस्तार axons दोनों अंतर्जात छत प्लेट और अस्थानिक पार्श्व ऊतक से संकेतों के प्रभाव के तहत विकसित होगा. डिग्री के लिए जो commissural axons इन परिस्थितियों के तहत पुनर्भिविन्यासित हैं मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इस परख का प्रयोग, यह संभव है दोनों एक विशेष commissural axons इस commissural 9 प्रक्षेपवक्र प्रत्यक्ष संकेत के लिए आवश्यकता के रूप में अच्छी तरह से 3,4 नई दिशा का संकेत के प्रचुरता की जांच करने के लिए.
Protocol
भाग 1: ट्रांसफ़ेक्ट COS कक्ष का समुच्चय तैयार हैंगिंग ड्रॉप का उपयोग
- बीज COS-7 (COS) 35 मिमी संस्कृति बर्तन में कोशिकाओं. जब वे 80% निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार Lipofectamine2000 का उपयोग कोशिकाओं में प्लास्मिड अभिव्यक्ति की confluency, transfect 1μg तक पहुँचने.
- बूँदें फांसी तैयार करने के लिए, अभिकर्मक मध्यम aspirate और 1ml 1x फास्फेट buffered समाधान (पीबीएस) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट COS कोशिकाओं कुल्ला. 15 मिनट के लिए सेल एंजाइम मुक्त पृथक्करण मध्यम 0.5ml के साथ कोशिकाओं को समझो. Opti-सदस्य + 1x पेनिसिलीन / / स्ट्रेप्टोमाइसिन Glutamine (पी / एस / G) + 10% भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम की प्रतिक्रिया को रोकने के समाधान के 1ml जोड़ें.
- Triturate कोशिकाओं संस्कृति डिश की सतह से उन्हें हटाने और एक 15ml शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित. गोली कोशिकाओं 2000K पर 2 मिनट के लिए स्पिन. Opti-सदस्य + 1x पी / एस / G + 10% FBS की 100μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें.
- एक 35 मिमी संस्कृति डिश ढक्कन के अंदर पर कई 20μl बूँदें स्पॉट, और डिश के तल के ऊपर पर ढक्कन जगह पलटना और एक 37 ° सी इनक्यूबेटर में कोशिकाओं कुल तक कई घंटे के लिए छोड़.
भाग 2: पृष्ठीय स्पाइनल कॉर्ड Explants की तैयारी
- E11 चूहा भ्रूण माँ के गर्भाशय से काटना और मध्यम l15 में बर्फ पर रखना जब तक जरूरत है.
- एक तेज टंगस्टन सुई के साथ, प्रत्येक भ्रूण के ट्रंक से 4-6 खंड खंड, तुरंत forelimb कली नीचे क्षेत्र से हटा दें. एक प्लास्टिक विंदुक का उपयोग, एक 4 अच्छी तरह Nunc पकवान की अच्छी तरह से एक में ऊतक के टुकड़े इकट्ठा करने और बर्फ पर रख.
- जब सभी भ्रूण क्षेत्रों dissected किया गया है, प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करें 1ml l15 के एक समाधान + Nunc पकवान की एक अच्छी तरह से दूसरा 1mg dispase में टुकड़े हस्तांतरण. के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट से अधिक लंबी नहीं सेते हैं. Dispase साथ टुकड़े ऊतकों पर नहीं सेते हैं.
- ऊष्मायन के दौरान, एक पेट्री डिश और मिश्रण ज़ुल्फ़ में के बारे में l15 के 10ml गर्मी निष्क्रिय सामान्य बकरी सीरम (HIGS) के 0.5ml जोड़ने. इस समाधान का एक तिहाई ही में Nunc डिश के 1ml स्थानांतरण और इस समाधान में ऊतक टुकड़े हस्तांतरण जब ऊष्मायन खत्म हो गया है. बर्फ पर रखें. नोट: बाद विच्छेदन आसान हो सकता है अगर ऊतक के टुकड़े को एक घंटे के लिए बर्फ पर "आराम" करने के लिए अनुमति दी हो जाएगा.
भाग 3: भड़काना कोलेजन
- 360μl कोलेजन 40μl 10x मिनिमल आवश्यक मध्यम जोड़ें flicking या संक्षेप vortexing ट्यूब के द्वारा तेजी से और मिश्रण अच्छी तरह से. नीचे तेजी से स्पिन picofuge में. समाधान पीले हो जितना संभव के रूप में में बर्फ पर रखें. .
- पर्याप्त 0.8M सोडियम बिकारबोनिट के लिए (3 NaHCO) थोड़ा संतरे का समाधान कोलेजन बारी (नीचे नोट देखें) जोड़ें. फिर, flicking द्वारा तेजी से और अच्छी तरह से मिश्रण है, और नीचे एक picofuge में संक्षेप में स्पिन. यदि समाधान मिश्रण के बाद गुलाबी रहता है, तो आप बहुत अधिक 3 NaHCO जोड़ लिया है और के लिए कोलेजन की एक ताजा ट्यूब के साथ फिर से शुरू करने की आवश्यकता होगी.
- इस बिंदु पर कोलेजन समाधान primed है. यह बर्फ पर तरल रहेगा, लेकिन बारे में 5 मिनट (गुलाबी मोड़) के भीतर जमना जब कमरे के तापमान के लिए लाया जाएगा.
- कोलेजन का एक 4 अच्छी तरह Nunc पकवान की प्रत्येक कुएं में स्पॉट 20μl. अपने विंदुक के टिप का उपयोग, कोलेजन से बाहर फैल एक छोटा सा "पैड" के रूप में. कमरे के तापमान पर सेट कोलेजन चलो.
नोट: 3 NaHCO की सटीक राशि कोलेजन के प्रत्येक बैच के लिए titrated हो की आवश्यकता होगी . कम (11μl) और फिर 0.5 1μl stepwise जोड़ने जब तक समाधान नारंगी की एक छोटी सी छाया है. "ठीक है" राशि आमतौर पर है 1ul की तुलना में कम 3 NaHCO की छोटी राशि है कि कोलेजन गुलाबी बारी होगी. 3 NaHCO की राशि रैखिक ऊपर या नीचे पैमाने पर नहीं है.
भाग 4: पृष्ठीय स्पाइनल कॉर्ड Explants और उनमें से COS कोलेजन मैट्रिक्स में सेल समुच्चय के साथ पोजिशनिंग के विच्छेदन
- एक नया तीव्रता टंगस्टन सुई और ठीक संदंश (# 5 या # 55) की एक जोड़ी का उपयोग, रीढ़ की हड्डी के आसपास mesoderm हटायें.
- टंगस्टन सुई के साथ मंजिल की थाली के समानांतर काटना, ध्यान से रीढ़ की हड्डी के उदर पांचवें हटा दें.
- पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी explant द्विविभाजित, यकीन है कि किनारों के रूप में सफाई संभव के रूप में काट रहे हैं. किनारों पुनः ट्रिम कर दीजिए, यदि आवश्यक. अलग कोलेजन एक मुँह पिपेट एक गिलास केशिका लगभग खींच ट्यूब के साथ फिट का उपयोग कर पैड पर प्रत्येक पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी explant स्थानांतरण. 0.5mm व्यास में.
- पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी explant के पार्श्व बढ़त के रूप में लगभग समान चौड़ाई के वर्ग में कट ट्रांसफ़ेक्ट COS कोशिकाओं की कुल.
- पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी explant के साथ कोलेजन पैड पर इन वर्गों के स्थानांतरण, एक मुँह पिपेट का उपयोग.
- मुँह विंदुक के साथ, किसी भी अतिरिक्त तरल मुंह पिपेट का उपयोग aspirate. Aspirate अधिक मत करो.
- Primed कोलेजन के 4μl पैड पर लागू करें, और, टंगस्टन सुई का उपयोगExplants से अधिक सीधे ऊतक छू बिना कोलेजन चाल. कोलेजन आसपास explants में टंगस्टन सुई आगे बढ़ करके, पूरबी explants इतना है कि COS कोशिकाओं कुल पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी explant के पार्श्व किनारे करने के लिए आसन्न है.
- कोलेजन के बाद की स्थापना की है, कोलेजन के 4μl के आवेदन को दोहराने के लिए सुनिश्चित करें कि explants पूरी तरह से कोलेजन में encased हैं.
- एक टिशू कल्चर हुड में, Opti-सदस्य + और 30-40 घंटे के लिए 1xP/S/G संस्कृति के 0.5ml जोड़ें.
- 1xPBS में 0.5ml paraformaldehyde 4% के साथ 45 मिनट के लिए explants ठीक है, बर्फ पर थाली रखने.
- 0.5ml 1xPBS के एक अवरुद्ध समाधान + 0.1 ट्राइटन-X100% 1% HIGS (PBTN) के साथ दो बार धोएं. 4 में ब्लॉक ° कम से कम घंटे के एक जोड़े के लिए सी, एक रात ऊष्मायन बेहतर और फिर immunohistochemistry द्वारा इस प्रक्रिया है.
भाग 5: immunohistochemistry द्वारा Commissural axons की विज़ुअलाइज़ेशन
- PBTN में अवरुद्ध करने के बाद, explants 4 संदंश और 48 अच्छी तरह से एक डिश में जगह के साथ एक अच्छी तरह से थाली के बाहर कटौती.
- प्रत्येक अच्छी तरह से प्राथमिक एंटीबॉडी के 200μl जोड़ें और 4 में रात भर छोड़ डिग्री सेल्सियस Commissural axons कल्पना करने के लिए, माउस प्रतिरक्षी विरोधी tag1 01:06 समाधान का उपयोग करें. यह निर्धारित करने के लिए क्या अभिकर्मक सफल रहा था के लिए, या तो संकेत अणु परीक्षण किया जा रहा है या प्रासंगिक मिलान अगर संकेत अणु का मिलान किया गया चिह्नित किया गया है के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी भी शामिल हैं.
- 4 में 5 x PBTN में 1 घंटे डिग्री सेल्सियस के लिए प्रत्येक नमूना धो
- प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यमिक एंटीबॉडी के 200μl जोड़ें और 4 में रात भर छोड़ डिग्री सेल्सियस यदि विरोधी tag1 एंटीबॉडी प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया, एक बकरी विरोधी माउस आईजीएम माध्यमिक या तो FITC या Cy3 मिलकर एंटीबॉडी का उपयोग करें. यदि प्रकाश के प्रति संवेदनशील माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग FITC या Cy3 करने के लिए युग्मित, 48 अच्छी तरह से इस बिंदु पर से पन्नी में कवर पकवान रहते हैं.
- प्रत्येक 5 नमूना x 4 में 1 घंटे PBTN में प्रत्येक डिग्री सेल्सियस धो
- 3 अच्छी तरह से एक अवसाद स्लाइड explant स्थानांतरण, अतिरिक्त तरल निकालने के लिए, Vectashield मध्यम और coverslip में माउंट. एक प्रकाश सुरक्षित बॉक्स में या तो 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
भाग 6: Explants के प्रतिनिधि छवियाँ
एक सफल प्रयोग में explant और COS कुल एक दूसरे से सटे बनी रहती है और बहाव के रूप में कोलेजन सेट के अलावा. Axons की न्यूनतम अतिवृद्धि हो जाएगा, महत्वपूर्ण axonal अतिवृद्धि इंगित करता है कि पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी explant भी लंबे समय के लिए संवर्धित किया गया था. कोई blebs explant से बढ़ रही हो जाएगा; blebbing होती है अगर ऊतक संस्कृति के माध्यम से सीधे संपर्क में आता है.
संकेत अणु की क्षमता को axons नई दिशा confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए मूल्यांकन किया है. अक्षतंतु पुनरभिविन्यास की हद COS सेल कुल 3 को निकटतम axons की पुनरभिविन्यास की औसत कोण को मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है . जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, COS कोशिकाओं व्यक्त myc टैग BMP7 (नीला) tag1 + commissural axons (हरा) BMP7 के स्रोत (चित्रा 1 बी) तरीके से छत की थाली के एक explant commissural axons (चित्रा repels के लिए इसी तरह से दूर नई दिशा 1 ए). COS किसी नियंत्रण वेक्टर व्यक्त कोशिकाओं commissural 3,4 axons के उन्मुखीकरण पर कोई प्रभाव नहीं है. इन explants भी प्रतिलेखन कारक Isl1 / 2 (लाल), जो मोटर न्यूरॉन्स और पृष्ठीय interneurons सजाता के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे थे. यह परिणाम पहला संकेत था कि बीएमपी परिवार mediates के एक सदस्य की गतिविधि छत प्लेट chemorepellent 3.
चित्रा 1: कृपया यहाँ क्लिक करने के लिए संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.
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Discussion
महत्वपूर्ण कारक है कि इस परख प्रदर्शन में सफलता का निर्धारण पहली बार कर रहे हैं, ऊतक भी लंबे समय अवधि के लिए dispase के साथ नहीं किया जा इलाज किया जाना चाहिए, इस तरह के उपचार के ऊतक बहुत चिपचिपा बनने और व्यवहार्यता की कमी हुई में परिणाम देगा. दो, कोलेजन पूरी तरह से हो सकता है और primed चाहिए जितना संभव के रूप में में बर्फ पर रखा है. यह तेजी से मुश्किल हो संभाल करने के लिए अगर यह सेट करने के लिए शुरू होता है, अर्थात गुलाबी बारी. तीन, टंगस्टन सुई हमेशा बहुत तेज रखा जाना चाहिए.
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Acknowledgments
इस प्रोटोकॉल जेन डोड, थॉमस Jessell और एंड्रयू Lumsden की प्रयोगशालाओं में विकसित किया गया था. कोनराड Basler, एन Calof, थॉमस Edlund, फिल हैमिल्टन Domna Karagogeos, एरियल Ruiz मैं Altaba और Toshiya यामादा सहित कई लोग निर्धारित कैसे कोलेजन में रीढ़ की हड्डी की संस्कृति explants. Marysia Placzek और मार्क Tessier - Lavigne अक्षतंतु मार्गदर्शन के अणुओं की पहचान के एक साधन के के रूप में इन विट्रो explants में से अक्षतंतु विकास का उपयोग करने की तकनीक का बीड़ा उठाया है. बटलर प्रयोगशाला में कार्य मार्च ऑफ डाइम्स और NS063999 R01 के NIH / NINDS से से अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 1 rat tail collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| 10x Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11430-030 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 51985-034 | |
| L15 | Invitrogen | 11415-064 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1166-8019 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech, Inc. | 35-016-CV | |
| Cell dissociation solution | EMD Millipore | S-004-C | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Invitrogen | 2520-0056 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Pen/Strep/Glutamate | Invitrogen | 10378-016 | |
| Paraformaldhyde | Baker/VWR | JTS898-7 | |
| Dispase | Roche Group | 10241750001 | |
| mouse anti Tag1 IgM (4D7) | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| mouse anti Myc IgG (9E10) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-40 | |
| goat anti mouse IgM FITC | Jackson | 115-095-075 | |
| goat anti mouse Fcy Cy3 | Jackson | 115-165-071 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210064 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 4 well Nunclon dish | Nalge Nunc international | 62407-068 | |
| 3 well depression slide | VWR international | 48339-009 | |
| 48 well dish | Falcon BD | 62406-195 | |
| Aspirator tuve assembly | FHC, Inc. | 30-32-0 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| #5 Dumont forcept | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 26016-12 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
- Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
- Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
- Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Dodd, J., Morton, S. B. Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons. Neuron. 1, 105-116 (1988).
- Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).
