Summary
Ce test évalue la capacité d'une molécule de signalisation, voici protéine morphogénétique osseuse 7 (BMP-7), à réorienter les axones commissuraux. Un explant de la moelle épinière embryonnaire dorsal est cultivée adjacente à un agrégat de cellules COS sécrétant des facteurs de croissance candidat. Réorienté axones commissuraux croissante au sein de l'explant sont visualisées par immunohistochimie.
Abstract
Dorsale axones commissuraux de la moelle épinière des vertébrés 1 ont été une précieuse système modèle dans lequel d'identifier des signaux de guidage axonal. Ici, nous décrivons un test in vitro, «le test de réorientation», qui a été largement utilisée pour étudier l'effet des signaux extrinsèques et intrinsèques de l'orientation des axones commissuraux 2. Ce test a été développé par de nombreuses personnes dans les laboratoires de Jane Dodd, Thomas et Andrew Lumsden Jessell (voir les remerciements pour plus de détails) et les versions de cet essai ont été utilisés pour démontrer les activités réorientation des principales molécules de guidage axonal, y compris le chemorepellent dans le BMP 3,4 toit en tôle et les activités des chimioattractives Netrin1 5 et Sonic Hedgehog (Shh) 6 dans la plaque de sol dans la moelle épinière.
Explants comprenant 2-3 segments de la dorsale des deux tiers de la moelle épinière sont disséqués par jour embryonnaire (E) 11 rats et de culture en trois dimensions des gels de collagène 7. E11 dorsale explants épinière contiennent les neurones nouvellement né commissurale, qui peuvent être identifiés par leur expression axonale de la glycoprotéine, Tag1 8. Au cours de 30-40 heures de culture, de la trajectoire des axones commissuraux est résumée dans ces explants dorsal avec un cours à temps similaire à celle observée in vivo. Cette trajectoire axonale peut être contestée en plaçant les tissus essai ou un agrégat de cellules COS exprimant une molécule candidate de signalisation en contact avec l'un des bords latéraux de l'explant dorsale. Axones commissuraux s'étendant au voisinage du tissu annexé feront croître sous l'influence de l'ensemble de la plaque de toit endogènes et les signaux provenant du tissu ectopique latéral. Le degré auquel les axones commissuraux sont réorientés dans ces circonstances peuvent être quantifiés. L'utilisation de ce test, il est possible à la fois d'examiner la suffisance d'un signal particulier de réorienter les axones commissuraux 3,4 ainsi la nécessité pour ce signal pour diriger la trajectoire commissurale 9.
Protocol
Partie 1: Préparation des agrégats de cellules COS transfectées avec gouttes suspendues
- COS-7 de semences (COS) des cellules dans des boîtes de culture de 35 mm. Quand ils atteignent 80% de confluence, 1 pg transfecter du plasmide d'expression dans les cellules en utilisant Lipofectamine2000 selon le protocole du fabricant.
- Pour préparer des gouttes pendantes, aspirer le milieu de transfection et rincer les cellules transfectées COS avec 1ml de solution tamponnée de phosphate 1x (PBS). Traiter les cellules avec 0,5 ml d'enzyme sans dissociation cellulaire moyen pendant 15 minutes. Ajouter 1 ml d'une solution d'Opti-MEM + 1x pénicilline / streptomycine / glutamine (P / S / G) + sérum fœtal bovin 10% (FBS) pour arrêter la réaction.
- Triturer les cellules pour les enlever de la surface de la boîte de culture et de transférer dans un tube 15ml conique. Spin 2 minutes à 2000K pour culotter les cellules. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 100 ul d'Opti-MEM + 1x P / S / G de FBS + 10%.
- Spot de plusieurs gouttes de 20 pi à l'intérieur d'un couvercle de boîte de culture 35mm, inverser le couvercle et placez-le sur le fond du plat et laisser dans un incubateur à 37 ° C pendant plusieurs heures jusqu'à ce que les cellules agrégées.
Partie 2: Préparation des explants dorsaux de la moelle épinière
- Disséquer embryons de rat E11 de l'utérus de la mère et de garder sur la glace dans du milieu L15 jusqu'à ce que nécessaire.
- Avec une aiguille de tungstène aiguisé, enlever un segment de l'article 4-6 du tronc de chaque embryon, à partir de la région immédiatement en dessous de patte avant bourgeon. Avec une pipette en plastique, de recueillir les morceaux de tissus dans un puits d'une antenne 4-même et de garder Nunc sur la glace.
- Lorsque tous les segments d'embryons ont été disséqués, utilisez la pipette en plastique pour transférer les morceaux dans une solution de 1ml L15 + 1mg dispase dans un deuxième puits de la vaisselle Nunc. Incuber à température ambiante pendant plus de 5 minutes. Ne pas trop incuber les morceaux de tissu avec de la dispase.
- Durant l'incubation, ajouter 0,5 ml de la chaleur du sérum de chèvre inactivé normal (HIGS) à environ 10ml de L15 dans une boîte de Pétri et agiter pour mélanger. Transfert 1ml de cette solution dans un troisième puits du plat Nunc et de transférer les morceaux de tissu dans cette solution lorsque l'incubation est terminée. Restez sur la glace. Remarque: la dissection subséquente sera plus facile si les morceaux de tissu sont autorisés à «reposer» sur la glace pendant une heure.
Partie 3: Collagène Amorçage
- Ajouter 40μl 10x milieu minimal essentiel au collagène 360μl, mélanger rapidement et complètement par agitation ou brièvement le tube de vortex. Isoler rapidement dans un picofuge. La solution sera jaune. Gardez sur la glace autant que possible.
- Ajouter suffisamment bicarbonate de sodium 0,8 M (NaHCO 3) pour mettre la solution de collagène légèrement orangé (voir note ci-dessous). Encore une fois, mélanger rapidement et complètement en feuilletant, et centrifuger brièvement dans un picofuge. Si la solution reste rose après mélange, vous avez ajouté trop de NaHCO 3 et devrez recommencer avec un nouveau tube de collagène.
- A ce point la solution de collagène est amorcée. Il restera liquide sur la glace, mais va se solidifier dans les 5 minutes (en tournant rose) lorsqu'elle est amenée à température ambiante.
- 20 pi spot de collagène dans chaque puits d'un plat 4-même Nunc. En utilisant la pointe de votre pipette, étalé le collagène pour former un petit "pavé". Laissez le collagène mis à température ambiante.
Remarque: Le montant exact de NaHCO 3 devront être titré pour chaque lot de collagène. Démarrer faible (11μl), puis ajouter 0,5 1 microlitre par étapes jusqu'à ce que la solution est une légère teinte d'orange. La "bonne" quantité est généralement inférieure à la 1UL plus petite quantité de NaHCO 3, que ferait le rose de collagène. Le montant de NaHCO 3 n'a pas d'échelle linéaire vers le haut ou vers le bas.
Partie 4: Dissection d'explants dorsaux de la moelle épinière et le positionnement d'entre eux avec des agrégats de cellules COS matrice collagène
- En utilisant une aiguille de tungstène fraîchement aiguisée et une paire de pinces fines (# 5 ou # 55), retirez le mésoderme qui entoure la moelle épinière.
- Coupe parallèle à la plaque au sol avec l'aiguille de tungstène, retirez soigneusement le cinquième ventrale de la moelle épinière.
- Couper en deux l'explant épinière dorsale, en s'assurant que les bords sont aussi proprement que possible coupées. Re-découpez les bords, si nécessaire. Transfert chaque explant épinière dorsale sur coussinets collagène séparées utilisant une pipette bouche équipé d'un tube capillaire en verre tiré à env. 0,5 mm de diamètre.
- Couper l'agrégat de cellules COS transfectées en carrés d'environ la même largeur que le bord latéral de l'explant épinière dorsale.
- Transfert un de ces carrés sur le tampon de collagène avec l'explant épinière dorsale, à l'aide d'une pipette bouche.
- Avec la pipette la bouche, aspirer hors tout excès de liquide à l'aide de la pipette bouche. Ne pas trop aspirer.
- Appliquer 4μl de collagène amorcée sur le pavé,et, en utilisant l'aiguille de tungstène, déplacez le collagène au cours de la explants, sans toucher directement les tissus. En déplaçant l'aiguille de tungstène dans le collagène entourant les explants, orienter les explants de sorte que l'ensemble des cellules COS est adjacent au bord latéral de l'explant épinière dorsale.
- Après le collagène a mis, répéter l'application de 4μl de collagène afin de s'assurer que les explants sont entièrement revêtus de collagène.
- Dans une hotte de culture de tissus, ajouter 0,5 ml d'Opti-MEM 1xP/S/G + et la culture pour 30-40 heures.
- Fix explants pendant 45 minutes avec du paraformaldéhyde 4% dans 0,5 ml 1xPBS, en gardant la plaque sur la glace.
- Laver deux fois avec 0,5 ml d'une solution de blocage des 1xPBS + 0,1% de Triton-X100 HIGS 1% (PBTN). Bloc à 4 ° C pendant au moins une couple d'heures, une nuit d'incubation est préférable et ensuite traiter par immunohistochimie.
Partie 5: Visualisation des axones commissuraux par immunohistochimie
- Après le blocage de PBTN, couper les explants de la plaque 4 et avec une pince et le placer dans un plat de 48 puits.
- Ajouter 200 ul d'anticorps primaires dans chaque puits et laisser une nuit à 4 ° C. Pour visualiser les axones commissuraux, utiliser une solution 1:6 de souris anti-Tag1 anticorps. Pour déterminer si la transfection a été un succès, incluent également un anticorps primaire contre la molécule de signalisation soit mis à l'essai ou l'épitope pertinente si la molécule de signalisation a été épitope étiqueté.
- Lavez chaque échantillon de 5 x 1 heure dans PBTN à 4 ° C.
- Ajouter 200 ul d'anticorps secondaire dans chaque puits et laisser une nuit à 4 ° C. Si l'anti-Tag1 anticorps ont été utilisés comme anticorps primaire, utiliser un anticorps de chèvre anti IgM de souris secondaire couplé à la FITC ou soit Cy3. Si vous utilisez sensible à la lumière des anticorps secondaire couplé à la FITC ou Cy3, garder le plat de 48 puits couvert de feuilles à partir de ce point.
- Laver chaque échantillon de 5 x 1 heure chacune dans PBTN à 4 ° C.
- Transfert explant à une diapositive de dépression 3-même, enlever l'excès de liquide, monter dans Vectashield moyen et lamelle. Conserver dans une boîte de lumière sécuritaire soit à 4 ° C ou -20 ° C.
Partie 6: des images représentatives de explants
Dans une expérience réussie, l'explant et globale COS restera adjacents les uns aux autres et ne pas dériver à part comme le collagène ensembles. Il y aura une prolifération minimale des axones; significative la prolifération axonale indique que l'explant épinière dorsale a été cultivé pendant trop longtemps. Il n'y aura pas de croissance des bulles de l'explant; blebbing se produit si le tissu est en contact direct avec le milieu de culture.
La capacité de la molécule de signalisation de réorienter les axones est évaluée en utilisant la microscopie confocale. L'étendue de la réorientation axonale peut être quantifiée en mesurant l'angle moyen de réorientation des axones plus proche de l'agrégat de cellules COS 3. Comme le montre la figure 1, les cellules COS exprimant myc-taggés BMP7 (bleu) + réorienter Tag1 axones commissuraux (vert) loin de la source de BMP7 (figure 1B), similaire à la manière dont un explant de la plaque de toit repousse des axones commissuraux (figure 1A). Des cellules COS exprimant un vecteur de contrôle n'ont aucun effet sur l'orientation des axones commissuraux 3,4. Ces explants ont également été marquées avec des anticorps contre le facteur de transcription ISL1 / 2 (rouge), qui orne les motoneurones et les interneurones dorsale. Ce résultat a été la première indication que membre de la famille BMP médiateur de l'activité des trois plaque de toit chemorepellent.
Figure 1:
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Discussion
Les facteurs critiques qui déterminent le succès dans l'accomplissement de ce test sont tout d'abord, le tissu ne doit pas être traitée avec dispase trop prolongée d'une période, un tel traitement se traduira dans le tissu devient très collant et ayant diminué la viabilité. Deux, le collagène doit être parfaitement apprêté et conservés sur la glace autant que possible. Il deviendra plus difficile à gérer si elle commence à mettre, c'est à dire virer au rose. Trois, l'aiguille de tungstène doivent toujours être très forte.
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Acknowledgments
Ce protocole a été développé dans les laboratoires de Jane Dodd, Thomas et Andrew Lumsden Jessell. Beaucoup de gens, y compris Konrad Basler, Ann Calof, Thomas Edlund, Phil Hamilton, Domna Karagogeos, Ariel Ruiz i Altaba et Toshiya Yamada déterminé comment la culture des explants de moelle épinière dans le collagène. Marysia Placzek et Marc Tessier-Lavigne pionnier de la technique d'utilisation de la croissance axonale à partir dans des explants in vitro comme un moyen d'identifier les molécules de guidage axonal. Le travail dans le laboratoire de Butler est soutenu par des subventions de la Mars of Dimes et R01 NS063999 du NIH / NINDS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 1 rat tail collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| 10x Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11430-030 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 51985-034 | |
| L15 | Invitrogen | 11415-064 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1166-8019 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech, Inc. | 35-016-CV | |
| Cell dissociation solution | EMD Millipore | S-004-C | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Invitrogen | 2520-0056 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Pen/Strep/Glutamate | Invitrogen | 10378-016 | |
| Paraformaldhyde | Baker/VWR | JTS898-7 | |
| Dispase | Roche Group | 10241750001 | |
| mouse anti Tag1 IgM (4D7) | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| mouse anti Myc IgG (9E10) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-40 | |
| goat anti mouse IgM FITC | Jackson | 115-095-075 | |
| goat anti mouse Fcy Cy3 | Jackson | 115-165-071 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210064 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 4 well Nunclon dish | Nalge Nunc international | 62407-068 | |
| 3 well depression slide | VWR international | 48339-009 | |
| 48 well dish | Falcon BD | 62406-195 | |
| Aspirator tuve assembly | FHC, Inc. | 30-32-0 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| #5 Dumont forcept | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 26016-12 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
- Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
- Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
- Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Dodd, J., Morton, S. B. Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons. Neuron. 1, 105-116 (1988).
- Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).
