Summary
Este ensaio avalia a capacidade de uma molécula de sinalização, aqui proteína morfogenética óssea 7 (BMP7), para reorientar axônios comissurais. Um explante da medula espinhal dorsal embrionárias cultivadas é adjacente a um agregado de células secretoras de COS os fatores de crescimento candidato. Reorientou axônios comissurais crescendo dentro do explante são visualizados através da imuno-histoquímica.
Abstract
Dorsal axônios comissurais na medula espinhal dos vertebrados 1 ter sido um modelo de sistema de valor inestimável em que identificar sinais de orientação axônio. Aqui, descrevemos um ensaio in vitro ", a reorientação do ensaio", que tem sido amplamente utilizado para estudar o efeito dos sinais extrínsecos e intrínsecos na orientação dos axônios comissurais 2. Este ensaio foi desenvolvido por várias pessoas nos laboratórios da Jane Dodd, Thomas Jessell e Lumsden Andrew (ver agradecimentos para mais detalhes) e versões deste ensaio foram usadas para demonstrar as atividades reorientação de orientação das moléculas-chave axônio, incluindo o BMP chemorepellent na chapa de teto 3,4 e as atividades de quimioatratante Netrin1 5 e Sonic hedgehog (Shh) 6 na placa de fundo na medula espinhal.
Explantes compreendendo 2-3 segmentos da dorsal de dois terços da medula espinhal são dissecados a partir de dia embrionário (E) 11 ratos e cultivadas em três géis de colágeno dimensional 7. E11 dorsal explantes espinhal contém recém-nascido neurônios comissurais, que podem ser identificadas pela sua expressão axonal da glicoproteína, Tag1 8. Ao longo de 30-40 horas em cultura, a trajetória dos axônios comissurais está resumida nestas explantes dorsal com um curso de tempo similar ao observado in vivo. Essa trajetória axonal pode ser contestada, colocando tecidos ou de teste ou um agregado de células COS expressando uma molécula de sinalização candidato em contato com uma das bordas laterais do explante dorsal. Axônios comissurais estendendo na vizinhança do tecido anexado vai crescer sob a influência de ambas as placas do telhado do endógenos e sinais do tecido ectópico lateral. O grau em que os axônios comissurais são reorientadas sob essas circunstâncias podem ser quantificados. Com este ensaio, é possível tanto para examinar a suficiência de um sinal especial para reorientar axônios comissurais 3,4, assim a necessidade de este sinal para direcionar a trajetória comissural 9.
Protocol
Parte 1: Preparação de agregados de células COS Transfectados usando gotas de suspensão
- COS-7 sementes (COS), as células em placas de cultura de 35 mm. Quando chegar a 80% confluência, 1μg transfecção do plasmídeo de expressão para as células usando Lipofectamine2000 acordo com o protocolo do fabricante s.
- Para preparar pendurado gotas, aspire o meio de transfecção e lavar as células transfectadas COS com 1ml de 1x Phosphate Buffered Solution (PBS). Tratar células com 0,5 ml de enzima meio livre de células dissociação por 15 minutos. Adicionar 1ml de uma solução de Opti-MEM + 1x Penicilina / Estreptomicina / Glutamina (P / S / G) + 10% de soro fetal bovino (FBS) para parar a reação.
- Triturar as células para removê-los da superfície da placa de cultura e transferência para um tubo cônico 15ml. Rotação por 2 minutos a 2000K para agregar as células. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet em 100μl de Opti-MEM + 1x P / S / G + 10% FBS.
- Local várias quedas de 20μl no interior de uma tampa 35 milímetros cultura prato, inverter tampa e coloque em cima do fundo do prato e deixe em 37 ° C incubadora durante várias horas até que as células agregadas.
Parte 2: Preparação de explantes Dorsal da Medula Espinhal
- Dissecar embriões de ratos E11 do útero da mãe e manter em gelo em L15 médio até necessário.
- Com uma agulha de tungstênio afiada, remover uma seção segmento 4-6 a partir do tronco de cada embrião, a partir da região imediatamente abaixo forelimb bud. Usando uma pipeta, recolher os pedaços de tecido em um poço de um prato de 4 Nunc bem e manter em gelo.
- Quando todos os segmentos foram dissecados embrião, use a pipeta para transferir as peças em uma solução de 1ml L15 + 1mg dispase em um segundo poço do prato Nunc. Incubar a temperatura ambiente por mais de 5 minutos. Não mais de incubar os pedaços de tecido com dispase.
- Durante a incubação, adicionar 0,5 ml de soro de cabra calor inativado normal (HIGS) para cerca de 10ml de L15 em uma placa de Petri e agite para misturar. Transferência de 1 ml desta solução em um terceiro poço do prato Nunc e transferir os pedaços de tecido para esta solução quando o período de incubação é longo. Manter no gelo. Nota: a dissecção posterior será mais fácil se os pedaços de tecido têm permissão para "descansar" no gelo por uma hora.
Parte 3: Colágeno Priming
- Adicionar 40μl meio mínimo 10x essenciais ao colágeno 360μl, misture rapidamente e minuciosamente por um movimento súbito ou brevemente o tubo vortex. Girar rapidamente em uma picofuge. A solução será amarela. Mantenha no gelo, tanto quanto possível.
- Adicionar o suficiente de bicarbonato de sódio 0,8 M (NaHCO 3) para ligar a solução de colágeno ligeiramente laranja (ver nota abaixo). Mais uma vez, misture rapidamente e minuciosamente por um movimento súbito e spin down brevemente em um picofuge. Se a solução continua a ser cor de rosa após a mistura, você adicionou NaHCO demais 3 e terá de começar novamente com um novo tubo de colágeno.
- Neste ponto, a solução de colágeno está ferrado. Ele permanecerá líquido no gelo, mas solidifica dentro de cerca de 5 minutos (tornando-se rosa) quando à temperatura ambiente.
- 20μl local de colágeno em cada poço de uma placa de quatro poços Nunc. Usando a ponta de sua pipeta, espalhar-se o colágeno para formar um "bloco" de pequeno porte. Deixe o colágeno fixado em temperatura ambiente.
Nota: A quantidade exata de NaHCO 3 terão de ser ajustadas para cada lote de colágeno. Iniciar baixa (11μl) e em seguida, adicione 0,5 1μl gradual até que a solução é uma máscara leve de laranja. A quantidade "certa" é geralmente menos de 1ul a menor quantidade de NaHCO 3, que viraria a rosa colágeno. A quantidade de NaHCO 3 não escala linearmente para cima ou para baixo.
Parte 4: Dissecção da Dorsal Explantes da Medula Espinhal e Posicionamento deles com agregados celulares COS em Colágeno Matrix
- Usando uma agulha de tungstênio recém afiada e um par de pinças finas (# 5 ou # 55), remova o mesoderma em torno da medula espinhal.
- Corte paralelo à placa de fundo com a agulha de tungstênio, remova cuidadosamente o quinto ventral da medula espinhal.
- Bissetriz do explante dorsal da coluna vertebral, certificando-se que as bordas são cortadas de forma limpa possível. Re-aparar as arestas, se necessário. Transferir cada explante dorsal da coluna vertebral em almofadas de colágeno separado usando uma pipeta boca equipado com um tubo de vidro capilar puxado para aprox. 0,5 milímetros de diâmetro.
- Corte o agregado de células transfectadas COS em quadrados de aproximadamente a mesma largura que a borda lateral do explante dorsal da coluna vertebral.
- Transferência de um desses quadrados sobre o bloco de colágeno com o explante dorsal da coluna vertebral, com uma pipeta na boca.
- Com a pipeta na boca, aspirar fora de todo o excesso de líquido usando a pipeta na boca. Não mais de aspirar.
- Aplicar 4μl de colágeno injetado sobre o bloco, e, utilizando a agulha de tungstênio, Mova o colágeno ao longo dos explantes diretamente sem tocar no tecido. Movendo a agulha de tungstênio no colágeno ao redor dos explantes, orientar os explantes para que o agregado de células COS é adjacente à borda lateral do explante dorsal da coluna vertebral.
- Depois que o colágeno tem set, repetir a aplicação de 4μl de colágeno para garantir que os explantes são completamente envolto em colágeno.
- Em uma capa de cultura de tecidos, adicionar 0,5 ml de Opti-MEM + 1xP/S/G e cultura para 30-40 horas.
- Fix explantes por 45 minutos com paraformaldeído a 4% de 0,5 ml em 1xPBS, mantendo a placa de gelo.
- Lave duas vezes com 0,5 ml de uma solução de bloqueio de 1xPBS + 0,1% Triton-X100 HIGS +1% (PBTN). Bloco no 4 ° C por pelo menos um par de horas, uma noite para o dia de incubação é preferível e então o processo por imuno-histoquímica.
Parte 5: Visualização de Axônios comissural por Imunohistoquímica
- Após o bloqueio em PBTN, corte os explantes para fora da placa 4 bem com uma pinça e coloque em um prato de 48 também.
- Adicionar 200μl de anticorpos primário para cada bem e deixe durante a noite a 4 ° C. Para visualizar os axônios comissurais, use uma solução 1:06 de mouse de anticorpos anti-Tag1. Para determinar se a transfecção foi bem-sucedida, também incluem um anticorpo primário contra qualquer molécula de sinalização que está sendo testado, ou o epitopo relevante se a molécula de sinalização foi epítopo marcados.
- Lave cada amostra por 5 x 1 hora em PBTN a 4 ° C.
- Adicionar 200μl de anticorpo secundário para cada bem e deixe durante a noite a 4 ° C. Se anti-Tag1 anticorpos foram utilizados como anticorpo primário, use uma cabra de anticorpos IgM anti secundário do mouse acoplado a qualquer FITC ou Cy3. Se estiver usando sensível à luz anticorpos secundários acoplados a FITC ou Cy3, mantenha o prato de 48 bem coberta em papel alumínio a partir deste ponto.
- Lave cada amostra 5 x 1 hora cada um em PBTN a 4 ° C.
- Transferência dos explantes para um slide depressão 3-bem, retire o excesso de líquido, montagem em Vectashield médio e lamela. Armazenar em uma caixa de luz de segurança em cada 4 ° C ou -20 ° C.
Parte 6: Imagens Representante de explantes
Em um experimento bem sucedido, o explante e agregar COS permanecerá ao lado um do outro e não se afastar como o colágeno sets. Haverá overgrowth mínima de axônios; overgrowth axonal significativa indica que o explante dorsal da coluna vertebral foi cultivado por muito tempo. Não haverá bolhas de crescimento do explante; blebbing ocorre se o tecido entra em contato direto com o meio de cultura.
A capacidade da molécula de sinalização para reorientar axónios é avaliado através de microscopia confocal. A extensão da reorientação axônio pode ser quantificado através da medição do ângulo médio de reorientação dos axônios mais próximo à célula COS 3 agregada. Conforme mostrado na Figura 1, as células COS expressando-myc tag BMP7 (azul) reorientar Tag1 + axônios comissurais (verde) de distância da fonte de BMP7 (Figura 1B), semelhante à maneira em que um explante de chapa de teto repele axônios comissurais (Figura 1A). Células COS expressar um vetor de controle não têm efeito sobre a orientação dos axônios comissurais 3,4. Estes explantes foram também marcadas com anticorpos contra o fator de transcrição Isl1 / 2 (vermelho), que decora os neurônios motores e interneurônios dorsal. Este resultado foi a primeira indicação de que um membro da família BMP medeia a atividade dos três chapa de teto chemorepellent.
Figura 1: Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.
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Discussion
Os fatores críticos que determinam o sucesso na realização deste ensaio são, primeiro, o tecido não devem ser tratados com dispase por muito prolongado período, este tratamento irá resultar no tecido tornando-se muito pegajoso e ter uma redução da viabilidade. Dois, o colágeno devem estar perfeitamente preparados e mantidos em gelo, tanto quanto possível. Vai tornar-se cada vez mais difícil lidar com se começa a definir, ou seja, passam a rosa. Três, a agulha de tungstênio devem ser mantidos sempre muito afiada.
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Acknowledgments
Este protocolo foi desenvolvido nos laboratórios da Jane Dodd, Thomas Jessell e Lumsden Andrew. Muitas pessoas, incluindo Konrad Basler, Calof Ann, Edlund Thomas, Hamilton Phil, Karagogeos Domna, Ruiz Ariel i Altaba e Yamada Toshiya determinada como explantes cultura da medula espinhal em colágeno. Marysia Placzek e Marc Tessier-Lavigne foi pioneiro na técnica de utilização de crescimento do axônio em explantes in vitro como forma de identificar moléculas de orientação axônio. Trabalho no laboratório Butler é suportado por concessões do March of Dimes e R01 NS063999 de NIH / NINDS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 1 rat tail collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| 10x Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11430-030 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 51985-034 | |
| L15 | Invitrogen | 11415-064 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1166-8019 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech, Inc. | 35-016-CV | |
| Cell dissociation solution | EMD Millipore | S-004-C | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Invitrogen | 2520-0056 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Pen/Strep/Glutamate | Invitrogen | 10378-016 | |
| Paraformaldhyde | Baker/VWR | JTS898-7 | |
| Dispase | Roche Group | 10241750001 | |
| mouse anti Tag1 IgM (4D7) | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| mouse anti Myc IgG (9E10) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-40 | |
| goat anti mouse IgM FITC | Jackson | 115-095-075 | |
| goat anti mouse Fcy Cy3 | Jackson | 115-165-071 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210064 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 4 well Nunclon dish | Nalge Nunc international | 62407-068 | |
| 3 well depression slide | VWR international | 48339-009 | |
| 48 well dish | Falcon BD | 62406-195 | |
| Aspirator tuve assembly | FHC, Inc. | 30-32-0 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| #5 Dumont forcept | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 26016-12 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
- Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
- Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
- Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Dodd, J., Morton, S. B. Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons. Neuron. 1, 105-116 (1988).
- Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).
