Summary
Bu testte commissural aksonların yeniden yönlendirmek için bir sinyal molekülü yeteneği, burada kemik morfogenetik protein 7 (BMP7) değerlendirir. Embriyonik dorsal spinal kord bir eksplant COS hücreleri salgılayan aday büyüme faktörleri toplu bir komşu kültür. Eksplant içinde büyüyen Nokia'nın commissural aksonlar immünohistokimya ile görüntülendi.
Abstract
Omurgalı omurilik 1 Dorsal commissural aksonlar aksona yol sinyalleri tanımlamak için paha biçilmez bir model sistem var. Burada, in vitro testi commissural aksonlar yönünü 2 dışsal ve içsel sinyalleri etkisini araştırmak için yaygın olarak kullanılan "yeniden yönlendirilmesi assay" açıklar. Bu testte, BMP, chemorepellent dahil olmak üzere, çok sayıda kişi tarafından Jane Dodd, Thomas Jessell ve Andrew Lumsden laboratuarlarında geliştirilen (Daha fazla bilgi için teşekkürler) ve bu testte sürümlerini anahtar akson rehberlik molekülleri yeniden yönlendirilmesi faaliyetleri göstermek için kullanılan 3,4 ve Netrin1 5 ve Sonic Hedgehog (Shh) omurilik zemin plakasını 6 chemoattractive faaliyetleri çatı plakası.
Eksplantlarındaki 2-3 segmentlerinde omurilik dorsal üçte ikisini oluşturan embriyonik gün (E) 11 sıçan disseke ve üç boyutlu kolajen jeller 7 olarak kültür. E11 dorsal spinal eksplantlar glikoprotein, tag1 8 aksonal ifade tarafından tespit edilebilir, yeni doğan commissural nöronlar, içerir . Commissural akson yörünge kültür 30-40 saat boyunca, in vivo olarak görülen benzer bir ders ile bu sırt eksplantlar değinmeyecek. Bu aksonal yörünge test dokuları ya da dorsal eksplant lateral kenarlarından biri ile temas aday sinyalleme molekülü ifade eden bir COS hücre agrega ya koyarak itiraz edilebilir. Eklenen doku çevresinde uzanan Commissural aksonlar endojen çatı plaka ve ektopik lateral doku sinyalleri hem de etkisi altında büyüyecek. Bu koşullar altında commissural aksonlar Nokia'nın derecesi belirlenebilir. Bu testte kullanarak, hem de belirli bir sinyal commissural yörünge 9 doğrudan bu sinyal gerekliliği sıra commissural aksonlar 3,4 reorient yeterliliğini incelemek mümkündür.
Protocol
Bölüm 1: transfekte COS Hücreler Agrega hazırlanması Asma Damlalar
- Tohum COS-7 (COS) 35mm kültür kaplarına hücreler. % 80 üretici s protokole göre Lipofectamine2000 kullanarak hücrelerin içine plazmid ifade confluency, transfect 1μg ulaştığınızda.
- Damla asılı hazırlamak için, transfeksiyon orta aspirat ve transfekte COS hücreleri 1ml 1x Fosfat Tamponlu Çözümü (PBS) ile yıkayın. 0.5 ml, 15 dakika boyunca enzim ücretsiz cep disosiasyon orta hücreleri davranın. 1 ml reaksiyonu durdurmak için Opti-MEM + 1x Penisilin / Streptomisin / Glutamin (P / S / G) +% 10 fetal sığır serumu (FBS) bir çözüm ekleyin.
- Karışım hücrelerin kültür çanak yüzeyinden bunları kaldırmak ve konik tüp 15ml içine aktarmak için. 2000K az 2 dakika boyunca pelet hücreleri Spin. Opti-MEM + 1x P / S / G +% 10 FBS 100μl süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın.
- Invert çanak alt üst kapak ve yeri, 35mm kültür çanak kapağın iç tarafında birden fazla 20μl damla Spot ve hücrelerin toplam kadar birkaç saat için 37 ° C inkübatör bırakın.
Bölüm 2: Dorsal Omurilik eksplantlar hazırlanması
- E11 sıçan embriyolar anne rahim inceleyin ve gerektiği kadar L15 orta buz üzerinde tutmak.
- , Bilenmiş bir tungsten iğne ile ön ayakları tomurcuk hemen altındaki bölge, her embriyo gövde 4-6 segmentinde bir bölümü çıkarın. Plastik bir pipet kullanarak, 4-iyi Nunc çanak iyi bir doku parçaları toplamak ve buz üzerinde tutmak.
- Tüm embriyo segmentleri disseke, 1ml L15 + Nunc çanak iyi bir ikinci 1mg dispase bir çözüm adet aktarmak için plastik pipet kullanın. 5 dakikadan daha uzun süre oda sıcaklığında inkübe edin. Dispase ile doku parçaları üzerinde inkübe etmeyin.
- İnkübasyon sırasında, bir Petri kabı ve karıştırmak için girdap içine L15 hakkında 10ml ısı inaktive normal keçi serumu (HIGS) 0.5 ml ekleyin. Üçüncü bir Nunc çanak bu çözeltinin 1ml aktarın ve inkübasyon sona erdiğinde bu çözüm doku parçaları aktarmak. Buz üzerinde tutun. Not: doku parçaları, bir saat için buz üzerinde "rest" izin verilir sonraki diseksiyon daha kolay olacaktır.
Bölüm 3: Astar Kollajen
- 360μl kollajen 40μl 10x Minimal Essential Orta ekle, tüp ya da kısaca vorteks Flicking hızlı ve iyice karıştırın. Bir picofuge hızla aşağı spin. Çözüm sarı olacaktır. Mümkün olduğu kadar buz üzerinde tutun.
- (Aşağıdaki nota bakınız) biraz portakal kollajen çözüm açmak için yeterli 0.8M sodyum bikarbonat (NaHCO 3) ekleyin. Yine Flicking tarafından hızlı ve iyice karıştırın ve bir picofuge kısaca aşağı doğru döndürün. Çözüm karıştırıldıktan sonra pembe kalırsa, çok NaHCO 3 ekledik ve kollajen taze bir tüp ile tekrar başlatmak gerekecektir.
- Bu noktada kollajen çözüm astarlanmalıdır. Buz sıvı kalır, ancak yaklaşık 5 dakika (pembe dönüm) oda sıcaklığına getirilmelidir zaman içinde daha da pekiştireceğiz.
- 4-iyi Nunc çanak her iyi kollajen Spot 20μl. Pipetin ucu kullanarak, küçük bir "pad" oluşturmak için kolajen yayıldı. Oda sıcaklığında kollajen edelim.
Not: NaHCO 3 tam miktarı, kolajen her parti için titre edilmesi gerekir . Düşük Başlangıç (11μl) ve çözüm portakal hafif bir gölge kadar 0.5-1μl adım adım ekleyin. "Doğru" miktarı genellikle 1ul NaHCO 3 küçük miktarda kolajen pembe açacak daha az. NaHCO 3 miktarı doğrusal yukarı veya aşağı ölçekli değildir.
Bölüm 4: Dorsal Omurilik eksplantlar ve Kollajen Matrix COS Hücre Agregalar Onları yerleştirilmesi Diseksiyon
- Taze bilenmiş tungsten, ince forseps bir iğne ve çift (# 5 veya # 55) kullanarak, omuriliği saran mezoderm çıkarın.
- Tungsten iğne ile taban plakası ile paralel Kesme, omuriliğin ventral beşte dikkatlice çıkarın.
- Kenarları mümkün olduğu kadar temiz kesilmiş olduğunu emin olun, dorsal spinal eksplant iki eşit parçaya böler. Gerekirse, kenarları kırpın. Yaklaşık çekti cam kapiller tüp ile donatılmış bir ağız pipet kullanarak ayrı kollajen pabuçlarına her dorsal spinal eksplant aktarın. Çapı 0.5mm.
- Transfekte COS hücrelerinin toplam dorsal spinal eksplant lateral kenarı yaklaşık olarak aynı genişlikte kareler halinde kesin.
- Ağız pipet kullanarak bu kareler, dorsal spinal eksplant ile kollajen ped üzerine aktarın.
- Ağız pipet ile, ağız pipet kullanarak herhangi bir aşırı sıvı aspire. Aspirat bitmedi.
- Ped üzerine boyanabilir kollajen 4μl uygulayın ve tungsten iğne kullanarakEksplantlar üzerinde kollajen doku doğrudan dokunmadan hareket ettirin. Eksplantlar çevreleyen kollajen tungsten iğne hareket ettirerek, şark eksplantlar COS hücrelerinin toplam dorsal spinal eksplant lateral kenarına bitişik olduğunu.
- Kollajen sonra eksplantlar kollajen tamamen kaplı olduğundan emin olmak için kollajen 4μl uygulamayı tekrarlayın.
- Bir doku kültürü kaputu, 30-40 saat Opti-MEM + 1xP/S/G ve kültür 0.5 ml ekleyin.
- Eksplantlar, buz üzerinde plaka tutarak, 1xPBS olarak 0.5 ml% 4 paraformaldehid 45 dakika sabitleyin.
- 1xPBS engelleyici bir çözüm +% 0.1 Triton-X100 +1% HIGS (PBTN) 0.5 ml ile iki kez yıkayın. Blok 4 ° C en az birkaç saat, bir gecelik inkübasyon immünohistokimyasal süreç, daha sonra tercih ve.
Bölüm 5: İmmünohistokimya Commissural Aksonlar Görselleştirme
- PBTN ile bloke sonra, 48-iyi bir yemek yer ve forseps ile 4 plaka eksplantlar kesip.
- Her iyi birincil antikor 200μl ekleyin ve 4 gece bekletin ° C. Commissural aksonlar görselleştirmek için, fare anti-tag1 antikor 01:06 çözümü kullanın. Transfeksiyon başarılı olup olmadığını belirlemek için, aynı zamanda sinyal molekülüne epitopu etiketli varsa ya sinyalleme molekülü test veya ilgili epitopu karşı primer antikor içerir.
- 4 PBTN 5 x 1 saat ° C için her örnek yıkayın
- Her iyi ikincil antikor 200μl ekleyin ve 4 gece bekletin ° C. Primer antikor olarak anti-tag1 antikorları kullanılmış olsaydı, ya FITC veya Cy3 birleştiğinde bir keçi anti-fare IgG sekonder antikoru kullanın. Işığa duyarlı ikincil antikorlar kullanılarak FITC veya Cy3 birleştiğinde, bu noktada folyo ile kaplanmış 48-iyi çanak tutmak.
- Her numune yıkayın 5 ° C 4 x 1 saat PBTN içinde her
- 3-iyi bir depresyon slayt eksplant transfer Vectashield orta ve kapak, bağlama, aşırı sıvı kaldırmak. 4 ° C veya -20 ° C ya da hafif bir kasa Mağaza
Bölüm 6: eksplant Temsilcisi Görüntüler
Eksplant ve COS agrega başarılı bir deneyde, birbirine bitişik kalır ve kollajen setleri dışında kayması değil. Aksonların minimal aşırı çoğalma olacak; önemli aksonal üremesine yol çok uzun süre dorsal spinal eksplant kültür olduğunu gösterir. Eksplant büyüyen hiçbir blep olacak; doku kültür ortamı ile doğrudan temas haline gelirse blebbing oluşur.
Aksonların yeniden yönlendirmek için sinyal molekülü yeteneği konfokal mikroskopi kullanılarak değerlendirildi. Akson reorientation ölçüde COS hücre toplam 3 yakın aksonların yeniden yönlendirilmesi ortalama açı ölçümü ile belirlenebilir. Şekil 1'de gösterildiği gibi, COS hücreleri ifade myc etiketli BMP7 (mavi) bir çatı plaka eksplant commissural aksonlar iter (Şekil şekilde benzer BMP7 kaynak (Şekil 1B) uzak tag1 + commissural aksonlar (yeşil) reorient 1A). Kontrol vektör ifade COS hücreleri commissural aksonlar 3,4 yönünü üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Bu eksplantlarında da motor nöronlar ve dorsal internöronlar süsleyen transkripsiyon faktörü Isl1 / 2 (kırmızı) karşı antikorlar ile işaretlenmiştir. Bu sonuç, ilk belirtisi olduğunu BMP aile aracılık üyesi çatı plakası chemorepellent 3 aktivitesi.
Şekil 1: Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu testte gerçekleştirme başarısını belirlemek kritik faktörler, doku, çok uzun süre bir süre için dispase ile tedavi edilmesi gerektiğini, bu tedavi çok yapışkan hale doku ve canlılığı azalmış olan yol açacaktır. İki, kollajen mükemmel astar ve mümkün olduğu kadar buz üzerinde muhafaza edilmelidir. Ayarlamaya başlıyor işlemek için giderek daha zor olacak, yani pembe. Üç, tungsten iğne her zaman çok keskin tutulması gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu protokol, Jane Dodd, Thomas Jessell ve Andrew Lumsden laboratuvarlarında geliştirildi. Kollajen omurilik kültürü eksplantlar Konrad Basler, Ann Calof Thomas Edlund, Phil Hamilton, Domna Karagogeos, Ariel Ruiz i Altaba ve Toshiya Yamada da dahil olmak üzere birçok kişi belirlendi. Marysia Placzek ve Marc Tessier-Lavigne akson rehberliği moleküllerinin belirlenmesi için bir araç olarak in vitro eksplantlar akson büyüme kullanarak tekniğinin öncülüğünü yaptı. Butler, laboratuvar İş NIH / NINDS Dimes ve R01 NS063999 Mart hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 1 rat tail collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| 10x Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11430-030 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 51985-034 | |
| L15 | Invitrogen | 11415-064 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1166-8019 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech, Inc. | 35-016-CV | |
| Cell dissociation solution | EMD Millipore | S-004-C | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Invitrogen | 2520-0056 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Pen/Strep/Glutamate | Invitrogen | 10378-016 | |
| Paraformaldhyde | Baker/VWR | JTS898-7 | |
| Dispase | Roche Group | 10241750001 | |
| mouse anti Tag1 IgM (4D7) | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| mouse anti Myc IgG (9E10) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-40 | |
| goat anti mouse IgM FITC | Jackson | 115-095-075 | |
| goat anti mouse Fcy Cy3 | Jackson | 115-165-071 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210064 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 4 well Nunclon dish | Nalge Nunc international | 62407-068 | |
| 3 well depression slide | VWR international | 48339-009 | |
| 48 well dish | Falcon BD | 62406-195 | |
| Aspirator tuve assembly | FHC, Inc. | 30-32-0 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| #5 Dumont forcept | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 26016-12 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
- Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
- Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
- Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Dodd, J., Morton, S. B. Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons. Neuron. 1, 105-116 (1988).
- Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).
