Summary
Este ensayo evalúa la capacidad de una molécula de señalización, la proteína morfogenética ósea 7 aquí (BMP7), para reorientar axones de la comisura. Un explante de la médula espinal dorsal de embriones se cultivaron junto a un conjunto de células secretoras de COS los factores de crecimiento candidato. Reorientado axones de la comisura de crecimiento en el explante se visualizan mediante técnicas de inmunohistoquímica.
Abstract
Axones de la comisura dorsal de la médula espinal de vertebrados han sido un modelo de un sistema de valor incalculable en el que para identificar las señales de guía axonal. Aquí se describe un ensayo in vitro ", el ensayo de reorientación", que se ha utilizado ampliamente para estudiar el efecto de las señales intrínsecas y extrínsecas en la orientación de los axones de la comisura 2. Este ensayo fue desarrollado por numerosas personas en los laboratorios de Jane Dodd, Jessell Thomas y Andrew Lumsden (ver agradecimientos para más detalles) y las versiones de este ensayo se utilizaron para demostrar las actividades de la reorientación de las principales moléculas axón orientación, incluyendo la chemorepellent en el BMP techo de placa de 3,4 y las actividades de chemoattractive Netrin1 5 y Sonic Hedgehog (Shh) 6 en la placa de piso en la médula espinal.
Explantes que comprende 2-3 segmentos de la dorsal de dos tercios de la médula espinal se disecan a partir del día embrionario (E) 11 ratas y se cultivaron en tres dimensiones geles de colágeno 7. E11 espinal dorsal explantes contienen recién nacido neuronas comisurales, que pueden ser identificadas por su expresión axonal de la glicoproteína, Tag1 8. En el transcurso de 30-40 horas en la cultura, la trayectoria de los axones comisurales se resume en estas explantes dorsal con un tiempo similar a la observada en vivo. Esta trayectoria axonal puede ser impugnada mediante la colocación de cualquiera de los tejidos de prueba o un agregado de células COS que expresan una molécula de señalización candidato en contacto con uno de los bordes laterales de la explante dorsal. Axones de la comisura que se extienden en los alrededores del tejido adjunta crecerá bajo la influencia de la placa del techo y las señales endógenas de los tejidos laterales ectópico. El grado en que los axones de la comisura se reorientan en estas circunstancias se pueden cuantificar. El uso de este ensayo, es posible tanto a examinar la suficiencia de una señal en particular para reorientar axones de la comisura 3,4 y la necesidad de que esta señal para dirigir la trayectoria de la comisura 9.
Protocol
Parte 1: Preparación de los agregados de células transfectadas COS el uso de gotas colgantes
- COS-7 semillas (COS), las células en placas de cultivo de 35 mm. Cuando llegan a un 80% 1 g confluencia, transfectar del plásmido de expresión en las células utilizando Lipofectamine2000 según el protocolo del fabricante s.
- Para preparar las gotas colgantes, aspirar el medio de transfección y aclarar las células COS transfectadas con 1 ml de solución tampón fosfato 1x (PBS). Tratar las células con 0,5 ml de enzima libre de medio de disociación celular durante 15 minutos. Añadir 1 ml de una solución de Opti-MEM + 1x penicilina / estreptomicina / glutamina (P / S / G) + 10% de suero fetal bovino (SFB) para detener la reacción.
- Triturar las células para eliminar de la superficie de la placa de cultivo y la transferencia en un tubo cónico de 15 ml. Girar durante 2 minutos a 2000K para precipitar las células. Aspirar el sobrenadante y el pellet se resuspende en 100μl de Opti-MEM + 1x P / S / G + 10% de SFB.
- Lugar varias gotas de 20μl en el interior de la tapa de la cultura plato de 35 mm, invertir tapa y coloque en la parte superior de la parte inferior del plato y dejar en una incubadora a 37 ° C durante varias horas hasta que las células agregado.
Parte 2: Preparación de explantes dorsal de la médula espinal
- Diseccionar embriones E11 rata del útero de la madre y mantener en hielo en medio L15 hasta que sea necesario.
- Con una aguja de tungsteno afilado, quitar una sección dedicada al segmento 4.6 a partir del tronco de cada embrión, de la región inmediatamente por debajo de extremidad anterior brote. Con una pipeta de plástico, recoger los trozos de tejido en un pocillo de una placa Nunc de 4 bien y mantener en hielo.
- Cuando todos los segmentos del embrión han sido disecados, el uso de la pipeta de plástico para la transferencia de las piezas en una solución de 1 ml L15 + 1mg dispasa en un segundo pozo de la placa Nunc. Incubar a temperatura ambiente durante no más de 5 minutos. No más de incubar los trozos de tejido con dispasa.
- Durante la incubación, añadir 0,5 ml de suero inactivado por calor normal de cabra (HIGS) a unos 10 ml de L15 en una placa de Petri y agitar para mezclar. Transferencia de 1 ml de esta solución en un tercer pozo de la placa Nunc y la transferencia de las piezas de tejido en esta solución cuando la incubación se ha terminado. Mantener en hielo. Nota: la disección posterior será más fácil si los trozos de tejido se les permite "descansar" en el hielo durante una hora.
Parte 3: El colágeno cebado
- Añadir 40μl 10x Medio Esencial Mínimo de colágeno 360μl, mezcla rápida y completamente por el parpadeo o vortex brevemente el tubo. Girar rápidamente en un picofuge. La solución será de color amarillo. Mantener en hielo tanto como sea posible.
- Agregue bastante bicarbonato de sodio 0,8 M (NaHCO 3) a su vez, la solución de colágeno ligeramente anaranjado (ver nota abajo). Una vez más, mezcla rápida y completamente por el parpadeo, y de girar brevemente en un picofuge. Si la solución permanece rosa después de la mezcla, que ha añadido demasiado NaHCO 3 y tendrá que empezar de nuevo con un nuevo tubo de colágeno.
- En este punto la solución de colágeno está preparado. Seguirá siendo líquido en hielo, pero se solidifica dentro de unos 5 minutos (convirtiendo de color rosa), cuando a temperatura ambiente.
- 20μl punto de colágeno en cada pocillo de una placa Nunc de 4 pocillos. Con la punta de la pipeta, se extendió a cabo el colágeno para formar un pequeño "pad". Deje que el conjunto de colágeno a temperatura ambiente.
Nota: La cantidad exacta de NaHCO 3 tendrán que ser ajustadas individualmente para cada lote de colágeno. Comenzar con dosis bajas (11μl) y luego añadir 0,5 1μl paso a paso hasta que la solución es un leve matiz de color naranja. La cantidad "correcta" es por lo general menos de 1 ul la menor cantidad de NaHCO 3 que a su vez, la rosa de colágeno. La cantidad de NaHCO 3 no se escala linealmente hacia arriba o hacia abajo.
Parte 4: La disección de la médula espinal dorsal explantes y Posicionamiento de ellos con los agregados de células COS en la matriz de colágeno
- Utilizando una aguja de tungsteno y recién afilado y un par de pinzas finas (# 5 y # 55), retire el mesodermo que rodea la médula espinal.
- Corte paralelo a la placa de suelo con la aguja de tungsteno, retire con cuidado la quinta ventral de la médula espinal.
- Atraviesan el explante espinal dorsal, asegurándose de que los bordes son de corte limpio como sea posible. Volver a recortar los bordes, si es necesario. La transferencia de cada explante espinal dorsal en las almohadillas de colágeno por separado con una pipeta de boca provisto de un tubo capilar de vidrio tirado a aprox. 0,5 mm de diámetro.
- Cortar el agregado de células COS transfectadas en cuadrados de aproximadamente el mismo ancho que el borde lateral de la columna dorsal explante.
- La transferencia de uno de estos cuadrados en la plataforma de colágeno con el explante de la columna dorsal, utilizando una pipeta de boca.
- Con la pipeta de la boca, aspirar el exceso de líquido mediante la pipeta de boca. No más de aspirado.
- Aplicar 4μl de colágeno preparados a la almohadilla, y, con la aguja de tungsteno, Mueva el colágeno en los explantes, sin contacto directo con el tejido. Al mover la aguja de tungsteno en el colágeno alrededor de los explantes, orientar a los explantes de modo que la suma células COS se encuentra junto al borde lateral de la columna dorsal explante.
- Después de que el colágeno se ha puesto, repetir la aplicación de 4μl de colágeno para asegurar que los explantes son completamente encerrado en el colágeno.
- En una campana de cultivo de tejidos, añadir 0,5 ml de Opti-MEM 1xP/S/G + y la cultura de 30-40 horas.
- Fix explantes durante 45 minutos con 0,5 ml de paraformaldehído al 4% en 1XPBS, manteniendo la placa en el hielo.
- Lavar dos veces con 0,5 ml de una solución de bloqueo de 1XPBS + 0,1% Tritón-X100 HIGS 1% (PBTN). Bloquear a 4 ° C durante al menos un par de horas, una noche de incubación es preferible y proceso mediante técnicas de inmunohistoquímica.
Parte 5: Visualización de los axones de la comisura de inmunohistoquímica
- Tras el bloqueo en PBTN, cortar los explantes de la placa de 4 y con unas pinzas y colocar en un plato de 48 pocillos.
- Agregar 200μl de los anticuerpos primarios a cada pocillo y dejar toda la noche a 4 ° C. Para visualizar axones de la comisura, use una solución de 1:6 de ratón anti-Tag1 anticuerpos. Para determinar si la transfección fue un éxito, también incluyen un anticuerpo primario contra la molécula de señalización que se prueba, o el epítopo correspondiente, si la molécula de señalización ha sido epítopo etiquetados.
- Lave cada muestra de 5 x 1 hora en PBTN a 4 ° C.
- Agregar 200μl de secundaria de anticuerpos a cada pocillo y dejar toda la noche a 4 ° C. Si el anti-Tag1 anticuerpos fueron utilizados como anticuerpos primarios, use una cabra anti IgM secundario del ratón junto a cualquiera de FITC o Cy3. Si se utiliza la luz secundaria de anticuerpos sensibles acoplado a FITC o Cy3, mantener el plato de 48 bien cubierto en papel de aluminio a partir de ahora.
- Lavar cada muestra de 5 x 1 hora cada uno en PBTN a 4 ° C.
- Transferencia de explante a una diapositiva depresión 3-bien, retirar el exceso de líquido, montaje en Vectashield medio y tapar. Guarde en una caja fuerte de luz, ya sea en 4 ° C o -20 ° C.
Parte 6: Imágenes representativas de explantes
En un experimento exitoso, el explante y el agregado COS permanecerá junto a la otra y no se alejan como el colágeno conjuntos. Habrá un mínimo de crecimiento excesivo de los axones, el crecimiento excesivo axonal significativo indica que el explante de la columna dorsal se cultivó durante mucho tiempo. No habrá ampollas que crecen en el explante, vesiculación se produce cuando el tejido está en contacto directo con el medio de cultivo.
La capacidad de la molécula de señalización para reorientar los axones se evaluó mediante microscopía confocal. La extensión de la reorientación del axón puede ser cuantificado mediante la medición del ángulo medio de la reorientación de los axones más cercano al agregado de células COS 3. Como se muestra en la Figura 1, las células COS que expresan myc-etiquetados BMP7 (azul) cambie la orientación Tag1 + axones de la comisura (verde) de distancia de la fuente de BMP7 (fig. 1B), similar a la manera en que un explante de la placa del techo repele axones de la comisura (Figura 1A). Las células COS que expresan un vector de control no tienen ningún efecto sobre la orientación de los axones comisurales 3,4. Estos explantes se marcaron también con anticuerpos contra el factor de transcripción Isl1 / 2 (rojo), que decora las neuronas motoras y las interneuronas dorsal. Este resultado fue el primer indicio de que un miembro de la familia media en BMP la actividad de la placa del techo chemorepellent 3.
Figura 1: Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 1.
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Discussion
Los factores críticos que determinan el éxito en la realización de este ensayo son en primer lugar, el tejido no debe ser entendido con dispasa demasiado prolongada de un período, este tratamiento se traducirá en el tejido a ser muy pegajoso y con disminución de la viabilidad. Dos, el colágeno debe estar perfectamente preparado y mantenerse en hielo tanto como sea posible. Cada vez será más difícil de manejar si se empieza a configurar, es decir, a su vez de color rosa. Tres, la aguja de tungsteno debe estar siempre muy afilado.
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Acknowledgments
Este protocolo fue desarrollado en los laboratorios de Jane Dodd, Jessell Thomas y Andrew Lumsden. Muchas personas, incluyendo Konrad Basler, Calof Ann, Edlund Thomas, Hamilton Phil, Karagogeos Domna, Ariel Ruiz i Altaba y Yamada Toshiya determina la forma de explantes de la cultura de la médula espinal en el colágeno. Marysia Placzek y Marc Tessier-Lavigne fue pionero en la técnica de utilización de crecimiento de los axones de in vitro de explantos, como medio de identificación de las moléculas de orientación axón. El trabajo en el laboratorio de Butler es apoyado por becas de la Fundación March of Dimes y NS063999 R01 de NIH / NINDS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 1 rat tail collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| 10x Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11430-030 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 51985-034 | |
| L15 | Invitrogen | 11415-064 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1166-8019 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech, Inc. | 35-016-CV | |
| Cell dissociation solution | EMD Millipore | S-004-C | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Invitrogen | 2520-0056 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Pen/Strep/Glutamate | Invitrogen | 10378-016 | |
| Paraformaldhyde | Baker/VWR | JTS898-7 | |
| Dispase | Roche Group | 10241750001 | |
| mouse anti Tag1 IgM (4D7) | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| mouse anti Myc IgG (9E10) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-40 | |
| goat anti mouse IgM FITC | Jackson | 115-095-075 | |
| goat anti mouse Fcy Cy3 | Jackson | 115-165-071 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210064 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 4 well Nunclon dish | Nalge Nunc international | 62407-068 | |
| 3 well depression slide | VWR international | 48339-009 | |
| 48 well dish | Falcon BD | 62406-195 | |
| Aspirator tuve assembly | FHC, Inc. | 30-32-0 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| #5 Dumont forcept | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 26016-12 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
- Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
- Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
- Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Dodd, J., Morton, S. B. Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons. Neuron. 1, 105-116 (1988).
- Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).
