Summary
Dieser Test bewertet die Fähigkeit eines Signalmolekül, hier Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7), um kommissuralen Axone neu zu orientieren. Eine Explantation von embryonalen Rückenmark kultiviert wird neben einem Aggregat von COS-Zellen sekretieren der Kandidat Wachstumsfaktoren. Umorientiert kommissuralen Axone wachsen innerhalb der Explantation werden visualisiert durch Immunhistochemie.
Abstract
Dorsal kommissuralen Axone in der Wirbeltier-Rückenmark 1 haben einen unschätzbaren Modell, in dem Axon Führung Signale zu identifizieren gewesen. Hier beschreiben wir ein In-vitro-Assay, "die Neuausrichtung assay", die verwendet wurde ausgiebig um die Wirkung von äußeren und inneren Signale von der Orientierung der Axone kommissuralen-2-Studie. Dieser Test wurde von zahlreichen Menschen in den Labors von Jane Dodd, Thomas Jessell und Andrew Lumsden entwickelt (siehe Anerkennungen für weitere Details) und Versionen dieses Tests wurden verwendet, um die Neuausrichtung Aktivitäten der Schlüssel Axon Führung Moleküle nachzuweisen, einschließlich der BMP chemorepellent in der Dachblech 3,4 und die chemoattractive Aktivitäten Netrin1 5 und Sonic Hedgehog (SHH) 6 in die Bodenplatte in das Rückenmark.
Explantate aus 2-3 Segmenten der dorsalen zwei Drittel des Rückenmarks sind aus embryonalen Tag (E) 11 Ratten seziert und kultiviert im dreidimensionalen Kollagen-Gelen 7. E11 dorsalen Explantate enthalten neu geboren kommissuralen Neuronen, die durch ihre axonalen Ausdruck des Glykoprotein, Tag1 8 identifiziert werden können. Im Laufe von 30-40 Stunden in Kultur, ist die kommissuralen Axon Flugbahn in diesen dorsalen Explantate mit einer zeitlichen Verlauf ähnlich dem in vivo gesehen rekapituliert. Diese Axone Flugbahn kann, indem entweder Test Gewebe oder eine COS-Zelle aggregieren Ausdruck eines Kandidaten Signalmolekül in Kontakt mit einem der seitlichen Ränder der dorsalen Explantation angefochten werden. Kommissuralen Axone, die sich in der Nähe der beigefügten Gewebe wird unter dem Einfluss der beiden endogenen Dachblech und Signale aus der ektopischen seitlichen Gewebe wachsen. Der Grad der kommissuralen Axone unter diesen Umständen neu ausgerichtet werden kann quantifiziert werden. Unter Verwendung dieses Tests ist es möglich, sowohl auf die Angemessenheit eines bestimmten Signals, um neu zu orientieren kommissuralen Axone 3,4 sowie die Notwendigkeit für dieses Signal an die kommissuralen Flugbahn 9 direkte untersuchen.
Protocol
Teil 1: Vorbereitung der Aggregate von transfizierten COS-Zellen mit hängenden Tropfen
- Seed COS-7 (COS)-Zellen in 35-mm-Kulturschalen. Als sie 80% Konfluenz, transfizieren 1 g des Expressionsplasmids in die Zellen mit Lipofectamine2000 nach Angaben des Herstellers s-Protokoll zu erreichen.
- Zur Vorbereitung hängenden Tropfen absaugen Transfektionsmedium und spülen Sie die transfizierten COS-Zellen mit 1 ml 1x Phosphat-gepufferte Lösung (PBS). Gönnen Zellen mit 0,5 ml Enzym-freie Zelle Dissoziation Medium für 15 Minuten. 1ml einer Lösung von Opti-MEM + 1x Penicillin / Streptomycin / Glutamin (P / S / G) + 10% fötalem Rinderserum (FBS), um die Reaktion zu stoppen.
- Man reibt die Zellen, um sie von der Oberfläche der Kulturschale zu entfernen und in ein 15 ml konische Röhre. Spin 2 Minuten lang bei 2000K die Zellen zu pelletieren. Überstand entfernen und Pellet in 100 &mgr; l der Opti-MEM + 1x P / S / G + 10% FBS.
- Spot mehrere 20 &mgr; l Tropfen auf die Innenseite einer 35-mm-Kulturschale Deckel, Invertzucker Deckel und am oberen Rand des Boden der Schale und verlassen in einem 37 ° C Inkubator für mehrere Stunden, bis die Zellen aggregieren.
Teil 2: Herstellung von Rückenmark Explantate
- Dissect E11 Ratte Embryonen aus der Gebärmutter der Mutter und halten auf dem Eis in L15-Medium bis es gebraucht wird.
- Mit einem geschärften Wolframnadel, entfernen Sie eine 4-6 Segmentabschnitt aus dem Kofferraum eines jeden Embryo, aus der Region unmittelbar unterhalb forelimb Knospe. Mit einem Kunststoff-Pipette, sammeln die Gewebestücke in eine Vertiefung einer 4-Well Nunc Schüssel und halten Sie auf dem Eis.
- Wenn alle Segmente des Embryos wurden seziert, die Kunststoff-Pipette, um die Stücke in eine Lösung von 1 ml L15 + 1mg Dispase in einem zweiten Brunnen der Nunc Gericht zu übertragen. Inkubieren bei Raumtemperatur nicht länger als 5 Minuten. Nicht zu bebrüten die Gewebestücke mit Dispase.
- Während der Inkubation add 0,5 ml hitzeinaktiviertem normalem Ziegenserum (Treble) zu etwa 10 ml der L15 in eine Petrischale und wirbeln zu mischen. Transfer 1ml dieser Lösung in einen dritten Brunnen der Nunc Schüssel und übertragen Sie die Gewebestücke in diese Lösung, wenn die Inkubationszeit ist vorbei. Keep on ice. Hinweis: Die nachfolgende Dissektion wird erleichtert, wenn die Gewebestücke zu "Ruhe" auf Eis für eine Stunde erlaubt sind.
Teil 3: Priming Collagen
- Add 40 ul 10x Minimal Essential Medium zu 360μl Kollagen, schnell und gründlich zu mischen, indem flicking oder kurz vortexen die Röhre. Spin down schnell in einer picofuge. Die Lösung wird gelb sein. Keep on ice so viel wie möglich.
- Fügen Sie genug 0.8M Natriumhydrogencarbonat (NaHCO 3) auf die Kollagen-Lösung leicht orange drehen (siehe Hinweis unten). Wieder schnell und gründlich zu mischen, indem flicking und Spin-down kurz in einer picofuge. Bleibt die Lösung rosa nach dem Mischen, Sie haben zu viel NaHCO 3 zugegeben und müssen wieder von vorne anfangen mit ein frisches Röhrchen aus Kollagen.
- An diesem Punkt der Kollagen-Lösung ist grundiert. Es wird flüssig bleiben auf dem Eis, sondern wird innerhalb von ca. 5 Minuten (Drehen pink) verfestigen, wenn auf Raumtemperatur gebracht.
- Spot 20 &mgr; l von Kollagen in jede Vertiefung einer 4-Well Nunc Gericht. Mit der Spitze des Pipette verteilt das Kollagen zu einem kleinen "pad" zu bilden. Lassen Sie das Kollagen bei Raumtemperatur eingestellt.
Hinweis: Die genaue Höhe der NaHCO 3 muss für jede Charge von Kollagen titriert werden. Starten niedrig (11μl) und fügen Sie dann 0,5-1μl schrittweise, bis die Lösung eine leichte Schatten orange. Die "richtige" Menge ist in der Regel 1UL weniger als die kleinste Menge an NaHCO 3, dass das Kollagen rosa wiederum würde. Die Höhe des NaHCO 3 nicht linear nach oben oder unten skalieren.
Teil 4: Präparation Rückenmark Explantate und Positionierung von ihnen mit COS Zellaggregate in Kollagen-Matrix
- Mit einem frisch geschärften Wolframnadel und ein Paar von feinen Pinzette (# 5 oder # 55), entfernen Sie das Mesoderm Umgebung des Rückenmarks.
- Schneiden parallel zur Bodenplatte mit dem Wolfram-Nadel, entfernen Sie vorsichtig den ventralen Fünftel des Rückenmarks.
- Halbierung der dorsalen Wirbelsäule Explantation, um sicherzustellen, dass Kanten so sauber wie möglich schneiden. Re-Trim die Kanten, wenn nötig. Übertragen Sie jede dorsalen Explantat auf separate Kollagen-Pads mit einem Mund pipettieren mit einer Glaskapillare gezogen, um ca. ausgestattet. 0,5 mm im Durchmesser.
- Schneiden Sie die Summe von transfizierten COS-Zellen in Quadrate von ungefähr die gleiche Breite wie die seitlichen Rand des dorsalen Explantation.
- Übertragen eines dieser Quadrate auf die Kollagen-Pad mit der dorsalen Wirbelsäule Explantation, mit einem Mund pipettieren.
- Mit dem Mund pipettieren, absaugen überschüssige Flüssigkeit mit dem Mund pipettieren. Nicht zu saugen.
- Bewerben 4μl von grundierten Kollagen auf dem Pad, und mit dem Wolfram-NadelBewegen sich die Kollagen über die Explantate ohne direkte Berührung des Gewebes. Durch Bewegen der Wolframnadel in das Kollagen um die Explantate, orientieren die Explantate, so dass die COS-Zellen aggregieren neben dem seitlichen Rand der dorsalen Explantat wird.
- Nach dem Kollagen gesetzt hat, wiederholen Sie die Anwendung von 4μl von Kollagen, um sicherzustellen, dass die Explantate komplett eingehüllt in Kollagen sind.
- In einer Gewebekultur Kapuze, fügen Sie 0,5 ml Opti-MEM + 1xP/S/G und Kultur für 30-40 Stunden.
- Fix Explantate für 45 Minuten mit 0,5 ml 4% Paraformaldehyd in 1xPBS, halten die Platte auf Eis.
- Zweimal waschen mit 0,5 ml eines blockierenden Lösung von 1xPBS + 0,1% Triton-X100 +1% HIGS (PBTN). Block bei 4 ° C für mindestens ein paar Stunden, ist eine Inkubation über Nacht vorzuziehen und dann verarbeiten durch Immunhistochemie.
Teil 5: Visualisierung von kommissuralen Axone durch Immunhistochemie
- Nach der Blockierung in PBTN, schneiden Sie die Explantate aus der 4-Well-Platte mit einer Pinzette und in eine 48-Well-Schale.
- Add 200 ul der primäre Antikörper in jede Vertiefung und lassen Sie über Nacht bei 4 ° C. Zur Visualisierung kommissuralen Axone, verwenden Sie einem 1:6-Lösung von Maus-anti-Tag1-Antikörper. Um festzustellen, ob die Transfektion erfolgreich war, auch einen primären Antikörper entweder gegen das Signalmolekül getestet, oder der jeweilige Epitop, wenn das Signalmolekül hat Epitop markierten worden.
- Wash jede Probe für 5 x 1 Stunde in PBTN bei 4 ° C.
- Add 200 ul des sekundären Antikörper in jede Vertiefung und lassen Sie über Nacht bei 4 ° C. Wenn Anti-Tag1 Antikörper als primärer Antikörper verwendet wurden, verwenden Sie eine Ziege anti-Maus IgM sekundäre Antikörper gekoppelt, um entweder FITC oder Cy3. Bei Verwendung von lichtempfindlichen Sekundärantikörper FITC oder Cy3 gekoppelt, halten Sie die 48-well Schale in Folie ab diesem Zeitpunkt erfasst.
- Wash jeder Probe 5 x je 1 Stunde in PBTN bei 4 ° C.
- Transfer Explantation zu einem 3-gut Depression rutschen, zu entfernen überschüssige Flüssigkeit, mount in Vectashield mittel-und Deckglas. An einem leichten Safe entweder bei 4 ° C oder -20 ° C.
Teil 6: Repräsentative Bilder von Explantaten
In einem erfolgreichen Experiment, wird das Explantat und COS Aggregat bleiben nebeneinander und nicht auseinander driften, wie die Kollagen-Sets. Es wird minimal Überwucherung der Axone werden; signifikante axonale Überwucherung zeigt, dass die dorsalen Explantation zu lange war, kultiviert. Es wird keine Bläschen wächst aus dem Explantat werden; blebbing tritt auf, wenn das Gewebe in direkten Kontakt mit dem Kulturmedium.
Die Fähigkeit der Signalmolekül auf Axone Neuausrichtung wird anhand der konfokalen Mikroskopie. Das Ausmaß der Axon Neuorientierung kann durch Messung der mittleren Winkel der Neuorientierung der Axone am nächsten an der COS-Zelle Aggregat 3 quantifiziert werden. Wie in Abbildung 1 dargestellt, zum Ausdruck COS-Zellen myc-markierten BMP7 (blau) neu zu orientieren Tag1 + kommissuralen Axone (grün) entfernt von der Quelle des BMP7 (Abbildung 1B), ähnlich der Art und Weise, auf die ein Explantat der Dachplatte abstößt kommissuralen Axone (Abb. 1A). COS-Zellen, die eine Steuerung Vektor haben keinen Einfluss auf die Ausrichtung der kommissuralen Axone 3,4. Diese Explantate wurden auch mit Antikörpern gegen den Transkriptionsfaktor Isl1 / 2 (rot), die Motoneuronen und dorsalen Interneuronen schmückt gekennzeichnet. Dieses Ergebnis war der erste Hinweis darauf, dass ein Mitglied der BMP-Familie vermittelt die Aktivität der Dachplatte chemorepellent 3.
Abbildung 1: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.
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Discussion
Die kritischen Faktoren, die den Erfolg bei der Durchführung dieses Tests bestimmen, sind erstens die Gewebe nicht mit Dispase für zu lange einen Zeitraum behandelt werden, wird eine solche Behandlung in das Gewebe zu sehr klebrig und mit verminderter Tragfähigkeit führen. Zwei, muss das Kollagen perfekt vorbereitet werden und auf Eis gehalten so viel wie möglich. Es wird zunehmend schwieriger zu handhaben, wenn sie gesetzt beginnt, dh sich rosa färben. Drei, muss der Wolfram-Nadel stets sehr scharf sein.
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Acknowledgments
Dieses Protokoll wurde in den Labors von Jane Dodd, Thomas Jessell und Andrew Lumsden entwickelt. Viele Menschen, darunter Konrad Basler, Ann Calof, Thomas Edlund, Phil Hamilton, Domna Karagogeos, Ariel Ruiz i Altaba und Toshiya Yamada bestimmt, wie die Kultur Explantate des Rückenmarks in Kollagen. Marysia Placzek und Marc Tessier-Lavigne Pionier in der Technik der Verwendung von Axon-Wachstum von in vitro Explantate als Mittel zur Identifizierung von Axon Führung Moleküle. Die Arbeit in der Butler Labor ist durch Zuschüsse der March of Dimes und R01 NS063999 von NIH / NINDS unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 1 rat tail collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| 10x Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11430-030 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 51985-034 | |
| L15 | Invitrogen | 11415-064 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1166-8019 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech, Inc. | 35-016-CV | |
| Cell dissociation solution | EMD Millipore | S-004-C | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Invitrogen | 2520-0056 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Pen/Strep/Glutamate | Invitrogen | 10378-016 | |
| Paraformaldhyde | Baker/VWR | JTS898-7 | |
| Dispase | Roche Group | 10241750001 | |
| mouse anti Tag1 IgM (4D7) | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| mouse anti Myc IgG (9E10) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-40 | |
| goat anti mouse IgM FITC | Jackson | 115-095-075 | |
| goat anti mouse Fcy Cy3 | Jackson | 115-165-071 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210064 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 4 well Nunclon dish | Nalge Nunc international | 62407-068 | |
| 3 well depression slide | VWR international | 48339-009 | |
| 48 well dish | Falcon BD | 62406-195 | |
| Aspirator tuve assembly | FHC, Inc. | 30-32-0 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| #5 Dumont forcept | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 26016-12 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
- Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
- Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
- Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
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- Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).
