Summary
Ячейки проницаемыми сшивателя DSP [дитиобис-(сукцинимидил пропионат)] стабилизирует переходных и лабильной взаимодействия
Abstract
Динамичный характер клеточных механизмов часто построены на переходных и / или слабые ассоциации белка. Эти низкие взаимодействия близость исключает строгие методы выделения и идентификации белков сетей по всему белок. Использование химических сшивающих агентов позволяет селективной стабилизации лабильных взаимодействия, минуя биохимических ограничения для очистки. Здесь мы приводим протокол поддаются на клетки в культуре, которая использует homobifunctional сшивающий со спейсером руки 12 Å, дитиобис-(сукцинимидил proprionate) (DSP). DSP расщепляется снижение связь дисульфид присутствует в молекуле. Сшивка в сочетании с иммуноаффинной хроматографии белков интересов с магнитных гранул позволяет изолировать белковых комплексов, которые иначе не выдержат очистки. Этот протокол совместим с регулярными западных технологий пятном и она может быть расширены для идентификации белков методом масс-спектрометрии 1.
Стефани А. Zlatic и Перл В. Райдер способствовали в равной степени к этой работе.
Protocol
1. Подготовка к Сшивание
- Вам нужно будет пластина достаточное количество клеток, чтобы изоляция 500 мкг белка на стандартной реакции трубки. Одной трубки может быть достаточно для идентификации предполагаемого interactors белка интереса со стороны иммуноблота. В этом случае шарик связан материал может быть элюировали SDS-PAGE образца буфера (иммунопреципитации). Для анализа масс-спектрометрии, количество стандартных реакций должно быть увеличено минимум в десять раз и белковые комплексы должны быть элюировали вне конкуренции с пептида антигена признаны антитела используются (иммуноаффинной хроматографии). Такая стратегия позволит изоляции белковых комплексов без иммуноглобулина.
- Оптимальная плотность клеток для сшивания находится между 75% и 90% слияния. В странах с высоким слияния условиях, клетки имеют тенденцию накапливаться друг на друга, что снижает доступность для клеточной проницаемой сшивателя для всех клеток.
- Тип клеточной и экспериментальной условие должно быть наклеена на дне ячейки пластины. Мы регулярно включают элементы управления с транспортного средства.
- Подготовка всех решений, кроме решения DSP до сшивания.
- Подготовить запас фосфатном буферном растворе буфера с CaCl 2 0,1 мМ CaCl 2 и 1 мм (PBS / Ca / Mg) до начала эксперимента. Добавление ионов кальция и магния имеет решающее значение для адгезии клеток к культуре пластины в ходе эксперимента. Хранить при температуре 4 ° С.
- 50X Полное коктейль ингибиторов протеазы - 1 таблетка растворяется в 1 мл Milli-Q воды. Хранить при -20 ° C.
- 20% Тритон Х-100 отвешивать 10g тритон Х -100 и разбавленных в общем объеме 50 мл Milli-Q воды. Рок при 4 ° С в течение ночи и хранить при температуре 4 ° С до использования. Не хранить в течение более 1 месяца. Используйте разведения этого 20% акций подготовить лизис и IP буферов, описанных ниже.
- 50X DSP Тушение Решение 1М Трис до рН 7,4. Хранить при комнатной температуре.
- Подготовка 10x Буфер решение.
10X Буфер:- 50 мл 1 М HEPES
- 150 мл 5 М NaCl
- 10 мл 0,5 М EGTA
- 250 мкл 2 М MgCl 2
- Отрегулируйте рН до 7,4
- Принесите конечный объем до 500 мл
1x Буфер используется также в лизат и иммуно-магнитной осадков буферов.
Буфер 1X- 10 мМ Hepes
- 150 мМ NaCl
- 1 мМ EGTA
- 0,1 мМ MgCl 2
- рН 7,4
- Лизис буфера 1X буфера + 0,5% Тритон Х-100.
- Иммуно-магнитный осадков буфера (IP-Buffer) 1X буфера + 0,1% Тритон Х-100.
2. Подготовка Сшивание решений
- Подготовка решения DSP непосредственно перед нанесением к клеткам. DSP высоко гидрофобными и должно быть распущено в ДМСО до разведения в PBS / Ca / Mg буфера. Растворите 40 мг DSP в 1 мл ДМСО. Это делает 100 мМ раствор DSP (молекулярный вес ЦОС 404,42 г / моль).
- Теплый соответствующий объем PBS / Ca / Mg до 37 ° С с целью облегчения разведения DSP / ДМСО в PBS.
Объемы необходимых для различных размеров пластин:
6-луночный планшет 2 мл на лунку
10 см пластины 10 мл на чашку
15 см пластины 20 мл на чашку - Добавить 10 мкл ЦОС / ДМСО маточного раствора на каждый 1 мл теплой PBS / Ca / Mg. Добавить DSP / ДМСО маточный раствор по капле с повторным перемешиванием, пока все DSP не растворится. Сделать контрольный раствор из 10 мкл ДМСО добавляется каждый 1 мл PBS / Ca / Mg.
- Поместите все PBS / Ca / Mg решения в ледяной бане не более 10 мин.
3. Подготовка Клетки для сшивания
- Подготовка ледяной бане, которые будут соответствовать все пластины для сшивания или инкубации управления транспортным средством.
- Возьмите пластины из 37 ° C инкубатора и разместите их сразу в ледяной бане.
- Вымойте клетки в два раза ледяным PBS / Ca / Mg. Использование же объеме, что вы будете использовать для сшивателя инкубации (см. раздел 2.2).
- Удалите вторую вымыть и добавить либо контроль транспортного средства или DSP сшивания буферного раствора.
- Инкубировать на льду в течение двух часов. Вы должны проверить пластин примерно каждые двадцать минут, чтобы убедиться, что все клетки покрыты раствором. Вы можете заметить небольшое количество DSP осадок из раствора. Это нормально.
4. Инактивация Реакция DSP
- Подготовка 1X тушение DSP решение 20 мМ Трис рН 7,4 в PBS / Ca / Mg (20 мкл 1 М Трис рН 7,4 на каждые 1 мл PBS / Ca / Mg).
- Удалить управления транспортным средством и сшивания решений.
- Добавить ледяной инактивации раствора и инкубировать на льду в течение 15 минут.
5. Лизиса клеток
- Во время инкубации тушение DSP, подготовить буфер лизиса клеток на 0,5% Тритон Х-100 в буфере с полной коктейль ингибиторов протеазы. Добавьте 20 мкл 50X маточного раствора полных на каждый 1 мл буфера для лизиса.
- После 15 минут инкубации тушение DSP, мыть клетки в два раза с PBS / Ca / Mg.
- Добавить лизис буфера + комплект к клеткам и рок-при 4 ° С в течение 30 минут. Некоторые из них предложили объемы лизис буфера для различных размеров пластин:
- 6-луночный планшет 0,5 мл на лунку
- 10 см пластины 1 мл на чашку
- 15 см пластины 1 мл на чашку
- После лизиса, с помощью мобильного скребок для сбора клеток из пластины. Не забудьте сохранить лизатов на льду, чтобы минимизировать активность протеаз
- Спиновые клеточных лизатов в течение 15 минут при температуре 4 ° С в настольный мини-центрифуге при максимальной скорости (15,000 мкг).
- Внесите супернатант в новую пробирку. Откажитесь от гранул.
- Анализ белка и продолжить иммунопреципитации.
6. Подготовка Иммуно-магнитных гранул осадков
Примечание: Этот шаг обычно начинается сразу после начала 2 часа сшивания инкубации.
- Комбинат 30 мкл Dynal иммуномагнитный бусы, 500 мкл IP-буфера (1x буфера + 0,1% Тритон Х-100) и соответствующее количество антиген-специфические антитела к screwtop микроцентрифужных труб. Подготовка антител свободными и неспецифических антител труб для отрицательного контроля. Соответствующее количество антител, должны определяться на основе индивидуальных антигенов в отдельных экспериментов. Этикетка все IP-трубок.
- Разрешить IP труб для инкубации в конце сравнению с аналогичным периодом конца рокер при комнатной температуре в течение двух часов. Кроме того, инкубировать IP-трубки с антителами в течение ночи при 4 ° день до сшивания.
- После инкубации, сделать быстрый 10-секундный мини-центрифугирования собрать бусины в нижней части трубы.
- Слайд трубы в магнитный держатель, который будет тянуть магнитных шариков от нижней части трубы. С бисером безопасно в сторону, теперь можно легко смыть несвязанного антитела.
- Использование малого диаметра наконечника аспиратора, таких как кончик гелем погрузки, или P200 наконечник для удаления буфера инкубации и несвязанного антитела. Как только объем инкубации удаляют добавить в 1 мл IP-буфера.
- Крышка трубки, мягко повторно приостанавливать бисера и инкубировать все IP труб при комнатной температуре в течение 5 минут с конца по сравнению с аналогичным конце вращения.
- Повторите 5 минут мыть шаг (шаги 6,3 по 6,6) еще раз с новым миллилитр IP-буфера.
- IP-трубки могут оставаться в последние инкубации мыть до сшитого лизат готова быть добавлены в бисер.
7. Инкубируйте Сшитые лизат с иммуно-магнитного бисер
- После последнего мыть спину иммуно-магнитных гранул, вниз в мини-центрифуге в течение 10 секунд. Затем приступают к скольжению трубок в магнитный держатель.
- Опять же, с помощью небольшого отверстия наконечника стремление, удалить инкубации объемом от трубки. Сразу же добавить 500 мкл сшитый Клеточный лизат (при условии, лизат на 1 мкг / мл) пробирки с иммуно-магнитных гранул. Если вы будете использовать пептид конкуренции в качестве отрицательного контроля, соответствующее количество пептида должны быть включены в этот момент. Предыдущие эксперименты должны быть выполнены, чтобы определить соответствующие условия конкуренции пептида. Кроме того, вы можете иметь свободный лизат иммуно-магнитных гранул в качестве отрицательного контроля. В этом случае, сразу же добавить 500 мкл лизата Buffer (Буфер 1x + 0,5% Тритон Х-100) + комплект для иммуно-магнитных гранул.
- Аккуратно ресуспендирования бисером. Ресуспендировали бисером должно быть инкубировали при 4 °, в конце-по-конце вращения на 2 часа.
8. Вымойте Unbound лизат из бисера
- После лизат имел достаточно времени инкубации, сделать быстрый 10-секундный спина в мини-центрифугу. Затем вставьте трубы в магнитный держатель. Магнитный держатель следует хранить в ледяной бане в течение оставшейся части эксперимента.
- Использование малого диаметра наконечника аспиратора, удалить все несвязанные лизат. Сразу же после всех несвязанных лизат удаляется добавить 1 мл IP-буфера.
- Крышка трубки и осторожно ресуспендируют бисером.
- Как только бисер ресуспендировали повторить бусинка шаг гранулирования (8,1).
- Снова аспирата от всех инкубационного объема и сразу же добавить 1 мл IP-буфера, а затем крышку трубки.
- Аккуратно ресуспендирования бисером в IP-буфера. Инкубируйте ресуспендировали бисером в течение 5 минут при температуре 4 ° с конца по сравнению с аналогичным конце качалки.
- Повторите бусинка промывки (8,4 по 8,6) еще 4 раза.
9. Денатурировать Выборка и сбор из бисера
- После того как все иммуно-магнитных трубок осадков были вымыты, заново осадка бисером (8,1) и слайд-трубок вмагнитный держатель.
- Белки связан с иммуно-магнитных гранул удаляются в денатурирующих условиях. Аспирируйте от последнего мыть буфера IP и удалять IP-трубки от магнитного держателя.
- Добавить 1x гель Пример буфера для IP-трубки чуть выше шарик шарик объединить бус на дне пробирки снова. Количество образца буфера зависит от размера и гель, который будет использоваться. Возможно, вам придется слегка нажмите на дне пробирки, чтобы получить все бусины ресуспендировали в буфере Пример лари.
- Повторите процесс денатурации (9,2 через 9,3) для каждого IP-трубки.
- Иммуно-магнитных гранул ресуспендировали в гель буфера Пример затем нагревают при 75 ° С в течение 5 минут для завершения процесса денатурации.
- Как только образец был денатурированного он может быть запущен на SDS-PAGE гель для западных промокательной. Пустые Иммуно-магнитных гранул может быть повторно центрифугированием и удаляется из образца с магнитным держателем.
10. Элюирование Сшитые Комплексы с антигенных пептидов (иммуноаффинной хроматографии).
- После того как все иммуно-магнитных трубок иммунопреципитации были вымыты, заново осадка бисером (8,1) и слайд-трубок в магнитный держатель. Аспирируйте супернатант и добавить 10 мкл буфера дополнен антигенного пептида признаны антитела используются для immunoisolation белковых комплексов. Вы должны проверить концентрациях от 10-200 мкМ эффективного элюирования.
- Инкубируйте бисером в течение 2 ч при 4 ° C.
- Положите бисер в магнитном стенде и тщательно восстановить 10 мл элюируется материалом. Сохраните этот супернатант.
- Быстро мыть бисером буфером и отбросить стирки. Сохранить бисером.
- Добавить буфера гель Пример к сохраненному супернатант и бус до концентрации 1X. Инкубируйте этих труб при температуре 75 ° С в течение 5 минут.
- Анализ бисером и пептид элюата на SDS-PAGE. Элюата должен быть свободен от IgG как белка пятна SDS-PAGE или иммуноблотов (рис. 1В). Этот материал бесплатно IgG подходит для масс-спектрометрии.
Рисунок 1. Изоляция AP-3 взаимодействующих белковых комплексов и мембранных белков. НЕК293 () или PC12 клетках (Б) лечились либо в присутствии управления транспортным средством (ДМСО, нечетные полосы Рис 1А) или ДСП (даже полосы на рис. 1A или все полос движения в 1B рис). Разъяснено экстракты инкубировали либо с бисером в одиночку (рис. 1А, Lanes 3-4), рецептор трансферрина антител (рис. 1А, Lanes 5-6), или АП-3 δ антител (рис. 1А, Lanes 7-10, рис . 1Б, дорожки 1-10). Иммунные комплексы элюировали SDS-PAGE образца буфера (рис. 1А), буфер в одиночку или (рис. 1Б, дорожки 1-2), или буфер дополнен с увеличением концентрации пептидных антигенных δ соответствующих аминокислот 680 710 от человека δ-adaptin (NCBI: AAD03777; GI: 1923266) (рис. 1Б, дорожки 3-10). Этот пептид связывает δ антител. После элюирования пептида, супернатанты (S) и бисера (б) были проанализированы иммуноблоттинга (рис. 1В). AP-3, который обнаруживается с антителами против δ, β3 и σ3 подразделения, соосаждается со следующими растворимых факторов: клатрин тяжелой цепи (ХГС), БЛОК-1 субъединицы pallidin и HOPS комплекс vps33b субъединицы; а также мембранных белков фосфатидилинозитол-4-киназа II типа альфа (PI4KIIα) и цинка транспортер 3 (ZnT3). Обратите внимание на отсутствие IgG мыши в тяжелые цепи пептида элюируют супернатант на рис. 1В.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DSP, мембраны проницаемыми, химически приводимым сшивающий со спейсером руки 12 Å используется для стабилизации переходных взаимодействий белков 1,2,3,4. Здесь примером этой стратегии с адаптером комплекса AP-3 растворимый комплекс белок, который распознает и сортирует мембранных белков в пузырьки из эндосомы 5. АП-3 выборочно связывается с цинком транспортер ZnT3 и липидного киназы фосфатидилинозитол-4-киназа II типа альфа, но не рецептора трансферрина 1,4,6. Мы расширили эти наблюдения для определения АП-3 белка сетевого взаимодействия мембранных белков и цитозольного факторов методом масс-спектрометрии 1. Низкий фоне иммуно-магнитного осадков следующим сшивания для выявления взаимодействующих белков. Более того опубликовала каталог белков, которые связываются неселективно на магнитных гранул позволяет пройти первый ликвидации неспецифической изоляции и идентификации белков методом масс-спектрометрии 7. DSP использует амин-реактивного эфирных групп связать первичные амины, такие как лизина или аминоконцу кислотой белков. По денатурирующих условиях, молекулы DSP расщепляется на две части, оставляя короткий химических групп на связанных аминокислот. Для некоторых антигенов есть снижение иммунореактивности сигналов иммуноблота при сравнении равных нагрузках белка между ДМСО контроля и DSP обработанные клетки (Figure1A). Вполне возможно, что это снижение результатов из-за снижения сродства антител на DSP изменение остатка лизина. Помимо этих редких случаях, использование химического сшивания DSP повышает способность обнаруживать тесно взаимодействующих мембранно-связанных белков.
Белки или протеины комплексов периферических связанные с цитозольного листовки мембран, такие как AP-3 локализованы в мембранах при нормальной температуре инкубации 37 ° С. Тем не менее, при комнатной температуре 15-20 ° С АП-3 комплекс медленно перераспределяет в цитозоле. Таким образом, с целью захвата взаимодействия между АП-3 и мембранных белков, связанных с, температура внутри этих клеток должно быть быстро охлаждается до 4 ° C. Лучший способ сделать это: 1) все буферы вынашиваются в ледяной бане до удаления клеток от 37 ° С инкубатор, 2), чтобы немедленно удалить все теплые СМИ с пластинки клеток и замена с ледяной буфер, и 3) сохранить клетки подвешенный на ледяной бане в течение полноту сшивания эксперимента.
DSP не растворяется в воде и таким образом потепление PBS / Ca / Mg решение до 37 ° С перед добавлением DSP / ДМСО решение является целесообразным. Однако, так как клетки необходимость поддержания температуры на 4 ° С, раствор сшивающего DSP должны быть помещены в ледяной бане один раз DSP полностью растворяются. Если DSP не полностью растворяются в больших количествах осадка составит как решение охлаждает (небольшое количество осадков нормально). Если большое количество осадков выпадает, попробуйте отопления решение вернуться к 37 ° С для полного растворения и recool. Если DSP неоднократно выпадает из раствора, возможно, потребуется подготовить свежий раствор сшивания. Быстрого удаления DSP из раствора из-за неполного растворения не следует путать с медленным образованием кристаллический слой, который появляется в скважинах DSP обработанные клетки. Наличие этого DSP кристаллический слой не мешает сшивания реакции в клетках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья В. Ф. (NS42599 и GM077569).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | P4417 | Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM |
| Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22585 | Moisture sensitive, store in air tight container 4°C |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG | Invitrogen | 110.31 | Beads are also available as sheep anti-rabbit |
| Dyna-Mag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
References
- Salazar, G. Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells. J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate. J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).
- Xiang, C. C. Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling. Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).
- Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic. Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).
- Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery. J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).
- Salazar, G. The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation. Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).
- Trinkle-Mulcahy, L. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
