Summary
सेल पारगम्य डीएसपी crosslinker [dithiobis (succinimidyl propionate)] स्थिर क्षणिक और अस्थिर बातचीत
Abstract
सेलुलर मशीनरी के गतिशील स्वभाव अक्सर क्षणिक और / या कमजोर प्रोटीन संघों पर बनाया गया है. ये कम आत्मीयता बातचीत अलगाव और ब्याज की एक प्रोटीन के चारों ओर प्रोटीन नेटवर्क की पहचान के लिए कड़े तरीकों रोकता. रासायनिक crosslinkers का उपयोग अस्थिर बातचीत के चुनिंदा स्थिरीकरण की अनुमति देता है, इस प्रकार की शुद्धि के लिए जैव रासायनिक सीमाओं को दरकिनार. यहाँ हम वर्तमान संस्कृति में कोशिकाओं के लिए उत्तरदायी प्रोटोकॉल है कि एक स्पेसर के हाथ के साथ एक homobifunctional crosslinker का उपयोग करता है 12 ए, dithiobis (proprionate succinimidyl) (डीएसपी). डीएसपी Disulphide अणु में मौजूद बांड की कमी से cleaved है. चुंबकीय मोतियों के साथ ब्याज की प्रोटीन का immunoaffinity क्रोमैटोग्राफी साथ संयुक्त क्रॉस को जोड़ने प्रोटीन परिसरों कि अन्यथा शुद्धि नहीं झेलने होगा अलगाव की अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल नियमित रूप से पश्चिमी धब्बा तकनीक के साथ संगत है और यह प्रोटीन की पहचान के लिए किया जा सकता मास स्पेक्ट्रोमेट्री 1 के द्वारा बढ़ाया है.
स्टेफ़नी ए Zlatic और पर्ल वी. राइडर इस काम के लिए समान रूप से योगदान दिया.
Protocol
1. Crosslinking के लिए तैयारी
- आप थाली करने के लिए कक्षों की एक पर्याप्त संख्या की आवश्यकता के लिए मानक ट्यूब प्रतिक्रिया प्रति प्रोटीन की 500 μg के अलगाव की अनुमति देगा. एक एकल ट्यूब immunoblot द्वारा ब्याज की एक प्रोटीन के ख्यात interactors की पहचान के लिए पर्याप्त हो सकता है. इस मामले में मनका बाध्य सामग्री एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर (immunoprecipitation) के साथ eluted जा सकता है. मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए, मानक प्रतिक्रियाओं की संख्या कम से कम दस गुना वृद्धि की जानी चाहिए और प्रोटीन परिसरों एक पेप्टाइड इस्तेमाल किया (immunoaffinity क्रोमैटोग्राफी) एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्रतिजन के साथ प्रतियोगिता से eluted होना चाहिए. इस रणनीति immunoglobulin के मुक्त प्रोटीन परिसरों के अलगाव की अनुमति देगा.
- crosslinking के लिए इष्टतम सेल घनत्व 75% और 90% confluency के बीच है. उच्च confluency परिस्थितियों में, कोशिकाओं के एक दूसरे पर ढेर है, जो सभी कक्षों के लिए सेल पारगम्य crosslinker पहुँच घट जाती है करते हैं.
- सेल प्रकार और प्रयोगात्मक हालत सेल प्लेट के नीचे पर लेबल किया जाना चाहिए. हम नियमित रूप से वाहन के साथ अकेले नियंत्रण शामिल हैं.
- डीएसपी पहले crosslinking के समाधान को छोड़कर सभी समाधान तैयार है.
- CaCl 2 0.1 मिमी और 2 1 (पीबीएस / / Ca मिलीग्राम) मिमी प्रयोग शुरू करने से पहले CaCl के साथ फॉस्फेट-buffered खारा बफर स्टॉक तैयार है. इसके अलावा कैल्शियम और मैग्नीशियम आयनों के प्रयोग के दौरान संस्कृति की थाली करने के लिए कोशिकाओं के आसंजन के लिए महत्वपूर्ण है. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस
- 50X पूरा protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल - 1 गोली 1ml मिल्ली क्यू पानी में भंग. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
- 20% Triton एक्स 100 10g Triton एक्स -100 बाहर वजन और 50 मिलीलीटर मिल्ली क्यू पानी की कुल मात्रा में जलमिश्रित. 4 में रॉक डिग्री सेल्सियस रात भर दुकान और 4 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक. अधिक से अधिक 1 महीने के लिए दुकान मत करो. इस 20% शेयर के dilutions प्रयोग lysis और आईपी नीचे वर्णित बफ़र्स तैयार है.
- 50X डीएसपी शमन समाधान 1M से 7.4 पीएच तक Tris. कमरे के तापमान पर स्टोर.
- एक 10x बफर एक समाधान तैयार करें.
10X एक बफर:- 50 एमएल 1 एम HEPES
- 150 एमएल 5 एम NaCl
- 10 एमएल 0.5 एम EGTA
- 250 μL 2 एम MgCl 2
- 7.4 पीएच समायोजित
- 500 एमएल के अंतिम मात्रा लाओ
1x बफर lysate और इम्युनो - वर्षण चुंबकीय बफ़र्स में भी प्रयोग किया जाता है.
एक 1X बफर- 10 मिमी Hepes
- 150 मिमी NaCl
- 1 मिमी EGTA
- 0.1 मिमी 2 MgCl
- 7.4 पीएच
- Lysis बफर 1X बफर + 0.5% ट्राइटन X-100.
- इम्यूनो - चुंबकीय अवक्षेपण (आईपी बफर) 1X बफर बफर एक + 0.1% ट्राइटन X-100.
2. Crosslinking समाधान की तैयारी
- डीएसपी समाधान तुरंत कोशिकाओं को लागू करने से पहले तैयार करें. डीएसपी अत्यधिक hydrophobic है और DMSO में पीबीएस / / Ca मिलीग्राम बफर में गिराए पहले भंग किया जाना चाहिए. DMSO के 1 एमएल में डीएसपी के 40 मिलीग्राम भंग. यह डीएसपी (डीएसपी के आणविक वजन 404.42 छ / mol है) की एक 100 मिमी समाधान बनाता है.
- पीबीएस / / Ca मिलीग्राम की एक उचित मात्रा गर्म 37 डिग्री सेल्सियस के क्रम में पीबीएस में डीएसपी / DMSO के कमजोर पड़ने की सुविधा के लिए.
मिश्रित प्लेट आकार के लिए की जरूरत खंड:
प्रति प्लेट में अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से 2 एमएल
10 प्रति प्लेट सेमी प्लेट 10 एमएल
प्लेट प्रति 15 सेमी प्लेट 20 एमएल - गर्म पीबीएस / / Ca मिलीग्राम के हर 1 एमएल के लिए / डीएसपी DMSO के शेयर समाधान के 10μL जोड़ें. ड्रॉप दोहराया मिश्रण के साथ द्वारा डीएसपी / DMSO के शेयर समाधान ड्रॉप जोड़ें जब तक सभी डीएसपी को भंग कर दिया है. 10 μL पीबीएस / / Ca मिलीग्राम के हर 1 एमएल जोडी DMSO के नियंत्रण समाधान करें.
- 10 मिनट से एक बर्फ के पानी अब स्नान में सभी पीबीएस / / Ca मिलीग्राम समाधान रखें.
3. Crosslinking के लिए तैयार कक्ष
- एक बर्फ के पानी स्नान है कि crosslinking या वाहन पर नियंत्रण ऊष्मायन के लिए सभी प्लेटों फिट होगा तैयार.
- 37 ° सी इनक्यूबेटर से प्लेटें ले लो और उन्हें बर्फ के पानी स्नान में तुरंत जगह.
- कोशिकाओं को ठंडा पीबीएस / / Ca मिलीग्राम के साथ दो बार धोएं. उसी मात्रा है कि आप crosslinker ऊष्मायन के लिए उपयोग (खंड 2.2 देखें) का प्रयोग करें.
- दूसरा धोने निकालें और या तो वाहन पर नियंत्रण या डीएसपी crosslinking बफर समाधान जोड़ें.
- दो घंटे के लिए बर्फ पर सेते हैं. आप प्लेटें लगभग हर बीस मिनट के लिए सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं समाधान द्वारा कवर कर रहे हैं जाँच करनी चाहिए. आप देख सकते हैं डीएसपी की एक छोटी राशि के समाधान के बाहर वेग. यह सामान्य है.
4. डीएसपी रिएक्शन की निष्क्रियता
- पीबीएस / / Ca मिलीग्राम (पीबीएस / / Ca मिलीग्राम के हर 1 एमएल के लिए 20 1 एम Tris पीएच 7.4 की μL) में 20 मिमी Tris 7.4 पीएच के एक 1X डीएसपी शमन समाधान तैयार करें.
- वाहन पर नियंत्रण और crosslinking समाधान निकालें.
- ठंडा निष्क्रियता समाधान जोड़ें और 15 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
5. सेल lysis
- डीएसपी शमन ऊष्मायन के दौरान 0.5% ट्राइटन बफर में X-100 A के साथ पूर्ण protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल के सेल lysis बफर तैयार करते हैं. 20 μL हर 1 एमएल lysis बफर के लिए पूरा के 50X शेयर समाधान जोड़ें.
- 15 मिनट डीएसपी शमन ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं पीबीएस / / Ca मिलीग्राम के साथ दो बार धोने.
- Lysis बफर + कोशिकाओं और 4 में रॉक पूरा ° सी 30 मिनट के लिए जोड़ें. कुछ मिश्रित प्लेट आकार के लिए lysis बफर की मात्रा का सुझाव दिया:
- प्रति प्लेट में अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से 0.5 एमएल
- 10 प्रति प्लेट सेमी प्लेट 1 एमएल
- प्लेट प्रति 15 सेमी प्लेट 1 एमएल
- Lysis के बाद, एक सेल खुरचनी का उपयोग करने के लिए थाली से कोशिकाओं को इकट्ठा. बर्फ पर lysates रखने के लिए protease गतिविधि कम से कम करने के लिए सुनिश्चित करें
- स्पिन सेल एक बेंच शीर्ष शीर्ष गति (15.000 XG) में मिनी अपकेंद्रित्र में 4 में 15 मिनट ° सी के लिए lysates.
- एक ताजा ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला पिपेट. गोली त्यागें.
- प्रोटीन के स्तर का विश्लेषण और immunoprecipitation के साथ आगे बढ़ना.
6. इम्यूनो चुंबकीय वर्षा मोती तैयारी
नोट: यह कदम आमतौर पर 2 घंटे crosslinking ऊष्मायन शुरुआत के बाद सीधे से शुरू कर दिया है.
- Dynal immunomagnetic मोतियों की 30 μL, आईपी बफर के 500 μL (1x बफर एक 0.1 +% ट्राइटन X-100) और प्रतिजन विशिष्ट एंटीबॉडी की उचित राशि के लिए microcentrifuge ट्यूबों screwtop मिश्रण. नकारात्मक नियंत्रण के लिए एंटीबॉडी मुक्त और गैर विशिष्ट एंटीबॉडी ट्यूबों तैयार करें. एंटीबॉडी के उचित मात्रा में अलग - अलग प्रयोगों के दौरान व्यक्तिगत प्रतिजनों के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए. सभी आईपी ट्यूबों लेबल.
- आईपी ट्यूबों दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक अंत पर अंत झूली कुरसी में सेते करने की अनुमति दें. वैकल्पिक रूप से, एंटीबॉडी के साथ आईपी ट्यूबों रातोंरात 4 ° सुबह पूर्व सेते crosslinking.
- ऊष्मायन के बाद, एक त्वरित 10 सेकंड मिनी centrifugation ट्यूब के नीचे मोती को इकट्ठा.
- चुंबकीय धारक, जो चुंबकीय मोतियों ट्यूब के नीचे से दूर खींच जाएगा में ट्यूब स्लाइड. सुरक्षित रास्ते से बाहर मोती के साथ, आप अब आसानी से दूर किसी भी अनबाउंड एंटीबॉडी धो सकते हैं.
- एक जेल लोड हो रहा है, टिप, या P200 टिप ऊष्मायन बफर और किसी भी अनबाउंड एंटीबॉडी हटाने जैसे एक छोटे से बोर Aspirator टिप का उपयोग करें. ऊष्मायन मात्रा के रूप में निकाल दिया जाता है जैसे ही आईपी बफर के 1 एमएल में जोड़ें.
- ट्यूब कैप, फिर निलंबित मोती धीरे, और अंत पर अंत रोटेशन के साथ 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सभी IP ट्यूबों सेते हैं.
- 5 मिनट धो (6.3 6.6 के माध्यम से कदम) अधिक एक बार आईपी बफर के एक ताजा मिली लीटर के साथ कदम दोहराएँ.
- आईपी ट्यूबों पिछले धोने ऊष्मायन में रहते हैं जब तक Crosslinked lysate मोती के लिए जोड़ा जा करने के लिए तैयार है.
7. इम्यूनो - चुंबकीय मोती के साथ Crosslinked lysate सेते
- पिछले धोने स्पिन इम्युनो - चुंबकीय मोतियों के बाद, नीचे 10 सेकंड के लिए एक मिनी अपकेंद्रित्र में. फिर चुंबकीय धारक में ट्यूबों की पर्ची के लिए आगे बढ़ें.
- फिर, एक छोटे बोर आकांक्षा टिप का उपयोग ट्यूब से ऊष्मायन की मात्रा को हटा दें. तुरंत इम्युनो - चुंबकीय मोतियों युक्त ट्यूबों के लिए Crosslinked सेल lysate (1 μg / एमएल lysate संभालने) के 500 μL जोड़ने. यदि आप एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पेप्टाइड प्रतियोगिता का उपयोग किया जाएगा, पेप्टाइड का एक उचित मात्रा में इस बिंदु पर शामिल किया जाना चाहिए. पिछले प्रयोगों के लिए उपयुक्त पेप्टाइड प्रतियोगिता शर्तों का निर्धारण किया जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, आप lysate एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में नि: शुल्क इम्युनो - चुंबकीय मोतियों के लिए चाहते हो सकता है. इस मामले में तुरंत lysate बफर (1x बफर ए + 0.5% ट्राइटन X-100) + इम्युनो चुंबकीय मोतियों को पूरा के 500 μL जोड़ें.
- धीरे मोती resuspend. Resuspended मोती 2 घंटे के लिए एक अंत पर अंत रोटेशन में 4 ° incubated होना चाहिए.
8. मोती से अनबाउंड lysate धो
- एक बार lysate पर्याप्त ऊष्मायन समय पड़ा है, एक त्वरित 10 मिनी अपकेंद्रित्र में दूसरे स्पिन. फिर चुंबकीय धारक में ट्यूब स्लाइड. चुंबकीय धारक प्रयोग के शेष के लिए एक बर्फ स्नान में रखा जाना चाहिए.
- एक छोटे बोर Aspirator टिप का उपयोग करना, सभी अनबाउंड lysate हटा दें. के तुरंत बाद सभी अनबाउंड lysate हटा दिया है आईपी बफर के 1 एमएल जोड़ें.
- ट्यूब कैप और धीरे मोती resuspend.
- एक बार मोती resuspended हैं मनका pelleting कदम (8.1) को दोहराएँ.
- फिर ऊष्मायन की मात्रा के सभी aspirate और तुरंत आईपी बफर के 1 एमएल जोड़ने, तो ट्यूब टोपी.
- धीरे आईपी बफर में मोती resuspend. अंत पर अंत कमाल के साथ 4 ° पर 5 मिनट के लिए resuspended मोती सेते हैं.
- मनका धोने कदम (8.4 8.6 के माध्यम से) 4 अधिक बार दोहराएँ.
9. नमूना denature और मोती से लीजिए
- बाद इम्युनो - चुंबकीय वर्षण ट्यूबों के सभी धोया गया है, फिर से तलछट (8.1) में और मोती स्लाइड ट्यूबोंचुंबकीय धारक.
- इम्युनो चुंबकीय मोतियों के लिए बाध्य प्रोटीन शर्तों denaturing में हटा रहे हैं. पिछले आईपी बफर धोने Aspirate और चुंबकीय धारक से IP ट्यूब हटा.
- बस के ऊपर मनका ट्यूब के नीचे मोती फिर पूल करने के लिए गोली आईपी ट्यूब 1x जेल नमूना बफर जोड़ें. नमूना बफर की राशि के लिए इस्तेमाल किया जा जेल की अच्छी तरह से आकार पर निर्भर करता है. आप धीरे ट्यूब के नीचे नल के लिए जेल नमूना बफर में resuspended मोती के सभी मिल की आवश्यकता हो सकती है.
- प्रत्येक IP ट्यूब के लिए denaturing प्रक्रिया (9.2 9.3 के माध्यम से) दोहराएँ.
- जेल नमूना बफर में इम्यूनो - चुंबकीय resuspended मोती तो 75 में गरम कर रहे हैं ° सी 5 मिनट denaturing प्रक्रिया को पूरा करने के लिए.
- एक बार नमूना विकृत किया गया है, यह पश्चिमी सोख्ता के लिए एक जेल एसडीएस पृष्ठ पर चलाए जा सकता है. खाली कर दिया इम्यूनो - चुंबकीय मोती centrifugation द्वारा पुनः pelleted और चुंबकीय धारक के साथ नमूना से हटाया जा सकता है.
10. प्रतिजनी पेप्टाइड्स के साथ Crosslinked परिसर (Immunoaffinity क्रोमैटोग्राफी) Elution.
- इम्युनो चुंबकीय immunoprecipitation ट्यूबों के सब के बाद धोया गया है, फिर से तलछट (8.1) चुंबकीय धारक में मोतियों और स्लाइड ट्यूब. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और बफर के 10 μl जोड़ने प्रतिजनी प्रोटीन परिसरों के immunoisolation के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त पेप्टाइड के साथ पूरक है. आप कुशल elution के लिए 10-200 सुक्ष्ममापी से लेकर सांद्रता का परीक्षण करना चाहिए.
- 4 में 2 घंटे के लिए मोती सेते डिग्री सेल्सियस
- चुंबकीय स्टैंड में मोती रखो और ध्यान से eluted सामग्री की 10 एमएल की वसूली. इस सतह पर तैरनेवाला सहेजें.
- जल्दी से एक बफर के साथ मोती धोने और धोने त्यागें. मोती सहेजें.
- बचाया सतह पर तैरनेवाला और मोती 1X का एक एकाग्रता के लिए जेल नमूना बफर जोड़ें. 75 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए इन ट्यूबों सेते हैं.
- एसडीएस PAGE द्वारा मोती और पेप्टाइड eluate विश्लेषण. eluate आईजीजी के दोनों एसडीएस पृष्ठ के दाग प्रोटीन द्वारा या immunoblots (चित्रा 1 बी) द्वारा मुक्त किया जाना चाहिए. यह आईजीजी के मुक्त सामग्री मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए उपयुक्त है.
चित्रा 1. एपी-3 बातचीत प्रोटीन परिसरों और झिल्ली प्रोटीन के अलगाव HEK293 कोशिकाओं (एक) या PC12 कोशिकाओं (बी) या तो वाहन पर नियंत्रण की उपस्थिति में इलाज किया गया (DMSO, अजीब गलियों चित्र 1 ए) या (भी गलियों अंजीर. डीएसपी 1A या सभी गलियों के चित्र 1B में). चित्र, स्पष्ट अर्क या तो अकेले मोती (छवि 1A, लेन 3-4), transferrin रिसेप्टर एंटीबॉडी (छवि 1A, 5-6 लेन), या एपी-3 δ एंटीबॉडी (छवि 1A, लेन 7-10 के साथ incubated रहे थे 1B, 1-10 गलियों). प्रतिरक्षा परिसरों एसडीएस PAGE नमूना बफर (छवि 1A) के साथ eluted थे, एक अकेला बफर या (छवि 1B, गलियों 1-2), या बफर δ प्रतिजनी पेप्टाइड की बढ़ती सांद्रता एमिनो एसिड 710 680 के लिए इसी के साथ पूरक (छवि 1B, गलियों 30-10):,: मानव δ - adaptin (१९२३२६६ सैनिक AAD03777 NCBI). यह पेप्टाइड δ एंटीबॉडी बांध. पेप्टाइड elution के बाद, (एस) supernatants और मोती (बी) immunoblot (छवि 1B) द्वारा विश्लेषण किया गया. , के रूप में के रूप में अच्छी तरह से क्लैथ्रिन भारी श्रृंखला (सीएचसी), ब्लॉक-1 सबयूनिट pallidin, और HOPS जटिल सबयूनिट vps33b: 3-एपी, जो δ, β3, और σ3 सब यूनिटों के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ पाया जाता है, निम्नलिखित घुलनशील कारकों के साथ coprecipitates झिल्ली phosphatidylinositol 4 kinase प्रकार द्वितीय (PI4KIIα) अल्फा और जस्ता ट्रांसपोर्टर 3 (ZnT3) प्रोटीन. नोट पेप्टाइड में आईजीजी माउस भारी जंजीरों के अभाव में छवि में सतह पर तैरनेवाला eluted. 1B.
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Discussion
डीएसपी, एक झिल्ली पारगम्य, 12 ए की एक स्पेसर भुजा के साथ रासायनिक कम करने योग्य crosslinker क्षणिक प्रोटीन 1,2,3,4 बातचीत को स्थिर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यहाँ हम एडाप्टर एपी 3 परिसर में एक घुलनशील प्रोटीन जटिल है कि पहचानता है और प्रकार vesicles में झिल्ली प्रोटीन से 5 endosomes के साथ इस रणनीति का उदाहरण है. एपी 3 चुनिंदा ZnT3 जस्ता ट्रांसपोर्टर और लिपिड kinase phosphatidylinositol-4-kinase प्रकार द्वितीय अल्फा लेकिन 1,4,6 नहीं रिसेप्टर transferrin को बांधता है. हम एक एपी 3 प्रोटीन झिल्ली प्रोटीन और साइटोसोलिक कारकों के द्वारा मास स्पेक्ट्रोमेट्री एक बातचीत के नेटवर्क की पहचान करने के लिए इन टिप्पणियों का विस्तार किया. निम्न पृष्ठभूमि इम्युनो चुंबकीय वर्षण बातचीत प्रोटीन की पहचान की crosslinking निम्नानुसार है. इसके अलावा प्रोटीन है कि गैर चुनिंदा चुंबकीय मोतियों के लिए बाध्य की एक प्रकाशित सूची मास स्पेक्ट्रोमेट्री 7 द्वारा एक गैर विशिष्ट प्रोटीन अलगाव और पहचान की पहले से गुजारें उन्मूलन के लिए अनुमति देता है. डीएसपी lysines या प्रोटीन के एमिनो एसिड टर्मिनस के रूप में प्राथमिक amines लिंक amine प्रतिक्रियाशील एस्टर समूहों का इस्तेमाल. Denaturing शर्तों पर, डीएसपी अणु आधे में cleaved है, लिंक्ड अमीनो एसिड पर कम रासायनिक समूहों को छोड़कर. कुछ प्रतिजनों के लिए वहाँ immunoblot द्वारा immunoreactivity संकेतों में एक कमी है जब DMSO के नियंत्रण और डीएसपी इलाज कोशिकाओं (Figure1A) के बीच बराबर प्रोटीन भार की तुलना. यह संभव है कि डीएसपी में कमी आई एंटीबॉडी आत्मीयता से इस कमी परिणाम lysines संशोधित. इन दुर्लभ मामलों के अलावा, डीएसपी रासायनिक crosslinking के उपयोग बारीकी से बातचीत झिल्ली जुड़े प्रोटीन का पता लगाने की क्षमता को बढ़ाता है.
प्रोटीन या प्रोटीन peripherally झिल्ली के साइटोसोलिक पत्रक के साथ जुड़े जैसे एपी 3 परिसरों, 37 के सामान्य ऊष्मायन तापमान डिग्री सेल्सियस पर झिल्ली के लिए स्थानीयकृत रहे हैं हालांकि, कमरे के तापमान पर 15-20 डिग्री सेल्सियस एपी 3-जटिल cytosol धीरे धीरे redistributes. इस प्रकार, क्रम में AP-3 और झिल्ली जुड़े प्रोटीन के बीच बातचीत पर कब्जा करने के लिए, इन कोशिकाओं के आंतरिक तापमान तेजी से 4 करने के लिए ठंडा होना चाहिए डिग्री सेल्सियस 1 करने के लिए सबसे अच्छा तरीका यह पूरा है) एक बर्फ स्नान में incubating 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर, 2 से कोशिकाओं को हटाने से पहले सभी बफ़र्स) कोशिकाओं की थाली से तुरंत गर्म मीडिया को हटाने और बर्फ के ठंडे बफर के साथ की जगह है, और 3) crosslinking प्रयोग की सम्पूर्णता के लिए एक बर्फ स्नान पर निलंबित कोशिकाओं को रखने के लिए.
डीएसपी के पानी में घुलनशील है और इस प्रकार पीबीएस / Ca मिलीग्राम / 37 के लिए समाधान वार्मिंग डिग्री सेल्सियस से पहले डीएसपी / DMSO के समाधान के अलावा उचित है नहीं है. हालांकि, बाद से कोशिकाओं को 4 के एक तापमान ° C बनाए रखने की जरूरत है, डीएसपी crosslinking समाधान एक बर्फ स्नान में रखा होना चाहिए एक बार पूरी तरह से डीएसपी solubilized है. यदि डीएसपी पूरी तरह solubilized नहीं है वेग की बड़ी मात्रा के रूप में समाधान ठंडा (वर्षा की एक छोटी राशि सामान्य है) के फार्म का होगा. यदि वर्षा की एक बड़ी राशि होती है, समाधान वापस ° पूरा solubilization और recool के लिए सी 37 हीटिंग की कोशिश करो. यदि डीएसपी समाधान के बार - बार बाहर हो जाता है, आप के लिए ताजा crosslinking समाधान तैयार करने की जरूरत हो सकती है. अधूरा solubilization के कारण समाधान से डीएसपी के तेजी से हटाने के एक क्रिस्टलीय परत है कि डीएसपी इलाज कोशिकाओं के कुओं में प्रकट होता है की धीमी गठन के साथ भ्रमित नहीं होना चाहिए. इस डीएसपी क्रिस्टलीय परत की उपस्थिति पार से जोड़ने की कोशिकाओं में प्रतिक्रिया के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है.
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Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य के VF संस्थान (NS42599 और GM077569) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | P4417 | Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM |
| Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22585 | Moisture sensitive, store in air tight container 4°C |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG | Invitrogen | 110.31 | Beads are also available as sheep anti-rabbit |
| Dyna-Mag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
References
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