Summary
Cellen genomsläppliga crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionat)] stabiliserar övergående och labil interaktioner
Abstract
Den dynamiska karaktären av cellulära maskineri ofta bygger på övergående och / eller svag protein föreningar. Dessa låg affinitet interaktioner utesluter stränga metoder för isolering och identifiering av protein nätverk kring ett protein av intresse. Användningen av kemiska bindemedel möjliggör selektiv stabilisering av labila interaktion, och därmed förbigå biokemiska begränsningar för rening. Här presenterar vi ett protokoll mottaglig för celler i kultur som använder en homobifunctional crosslinker med en spacer arm av 12 a, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP klyvs genom reduktion av en disulfid obligationer finns i molekylen. Bryggbindningen kombination med immunoaffinity kromatografi av proteiner av intresse med magnetiska kulor kan isolering av proteinkomplex som annars inte skulle klara reningen. Detta protokoll är kompatibelt med jämna Western Blot tekniker och det kan skalas upp för protein identifiering genom masspektrometri 1.
Stephanie A. Zlatic och Pearl V. Ryder bidragit lika för detta arbete.
Protocol
1. Förberedelser för crosslinking
- Du måste plattan ett tillräckligt antal celler för att möjliggöra isolering av 500 mikrogram protein per standard rör reaktion. Ett enda rör kan vara tillräckligt för identifiering av förmodade interactmedlemmar av ett protein av intresse genom immunoblot. I detta fall pärla bundna material kan elueras med SDS-PAGE prov buffert (immunoprecipitation). För masspektrometri analys bör antalet vanliga reaktioner ökas minst tio gånger och protein komplex bör elueras genom out-tävling med en peptid-antigen som erkänns av antikroppen som används (immunoaffinity kromatografi). Denna strategi gör det möjligt för isolering av proteinkomplex gratis immunglobulin.
- Den optimala celltäthet för crosslinking är mellan 75% och 90% confluency. I höga confluency förhållanden, celler tenderar att stapla på varandra, vilket minskar tillgängligheten till den cell-genomsläppliga crosslinker till alla celler.
- Celltyp och experimentella tillstånd bör märkas på botten av cellen plattan. Vi inkluderar rutinmässigt kontroller med fordonet ensam.
- Förbered alla lösningar, utom DSP lösning innan crosslinking.
- Förbered ett lager av fosfatbuffrad-saltlösning buffert med CaCl 2 0,1 mm och CaCl 2 1 mM (PBS / Ca / Mg) före start av experimentet. Tillägget av kalcium och magnesium joner är avgörande för vidhäftning av celler till kultur plattan under försöket. Förvaras vid 4 ° C.
- 50X Komplett Proteashämmare Cocktail - 1 tablett upplöst i 1 mL Milli-Q Water. Förvara vid -20 ° C.
- 20% Triton X-100 Väg upp 10g Triton X -100 och späd med total volym på 50 ml Milli-Q Water. Rock vid 4 ° C över natten och förvara vid 4 ° C fram till användning. Förvara inte mer än 1 månad. Använd utspädningar av denna 20% lager för att förbereda lys-och IP-buffertar beskrivs nedan.
- 50X DSP Släckning lösning 1M Tris till pH 7,4. Förvara i rumstemperatur.
- Förbered en 10x Buffer en lösning.
10X Buffert A:- 50 ml 1 M HEPES
- 150 ml 5 M NaCl
- 10 ml 0,5 M EGTA
- 250 mikroliter 2 M MgCl 2
- Justera pH till 7,4
- Ta slutliga volymen till 500 ml
1x buffert En används också i lysat och immuno-magnetiska-nederbörd buffertar.
Buffert en 1x- 10 mM Hepes
- 150 mM NaCl
- 1 mM EGTA
- 0,1 mM MgCl 2
- pH 7,4
- Lyseringsbuffert 1X Buffert A + 0,5% Triton X-100.
- Immuno-Magnetisk Nederbörd Buffer (IP Buffer) 1X buffert A + 0,1% Triton X-100.
2. Förbereda crosslinking Solution
- Förbered DSP lösningen omedelbart innan de ansöker till celler. DSP är mycket hydrofoba och ska lösas upp i DMSO innan spädning till PBS / Ca / Mg buffert. Lös upp 40 mg av DSP i 1 ml DMSO. Detta gör en 100 mm lösning av DSP (molekylvikt DSP är 404,42 g / mol).
- Varm en lämplig volym av PBS / Ca / Mg till 37 ° C för att underlätta utspädning av DSP / DMSO i PBS.
Volymer som behövs för diverse plåt storlekar:
6-brunnar 2 ml per brunn
10 cm tallrik 10 ml per platta
15 cm tallrik 20 ml per platta - Tillsätt 10μL av DSP / DMSO stamlösning för varje 1 ml varmt PBS / Ca / Mg. Lägg DSP / DMSO droppe stamlösning för droppe med upprepade blanda tills all DSP har löst sig. Gör en kontroll lösning med 10 mikroliter DMSO läggs till varje 1 mL PBS / Ca / Mg.
- Placera alla PBS / Ca / Mg lösningar i en is-vattenbad längre än 10 minuter.
3. Förbered celler för crosslinking
- Förbered en is-vatten bad som passar alla plattor för crosslinking eller fordonskontroll inkubation.
- Ta plåtar från 37 ° C inkubator och lägg dem omedelbart i isvatten bad.
- Tvätta cellerna två gånger med iskallt PBS / Ca / Mg. Använd samma volym som du ska använda för crosslinker inkubation (se avsnitt 2.2).
- Ta ANDRA TVÄTTNINGSSTEGET och antingen lägga till kontroll av fordon eller DSP crosslinking buffertlösning.
- Inkubera på is i två timmar. Du bör kontrollera att plattorna ungefär var tjugonde minut för att säkerställa att alla celler omfattas av lösningen. Du kan märka en liten mängd DSP fälls ut ur lösningen. Detta är normalt.
4. Inaktivering av DSP Reaktion
- Förbered en 1X DSP härdning lösning på 20 mM Tris pH 7,4 i PBS / Ca / Mg (20 mikroliter av 1 M Tris pH 7,4 för varje 1 mL PBS / Ca / Mg).
- Ta bort fordonskontroll och lösningar crosslinking.
- Tillsätt iskallt inaktivering lösning och inkubera på is i 15 minuter.
5. Cellslys
- Under DSP släcka inkubation, förbereda bufferten cellslys på 0,5% Triton X-100 i buffert A med komplett proteashämmare cocktail. Tillsätt 20 mikroliter 50X stamlösning av Komplett för varje 1 mL lyseringsbuffert.
- Efter 15 minuters DSP härdning inkubation, tvätta cellerna två gånger med PBS / Ca / Mg.
- Lägg lyseringsbuffert + Komplett till celler och sten vid 4 ° C i 30 minuter. Några föreslog volymer lyseringsbuffert för diverse plåt storlekar:
- 6-brunnar 0,5 ml per brunn
- 10 cm tallrik 1 ml per platta
- 15 cm tallrik 1 ml per platta
- Efter lys, använd en cell skrapa för att samla in celler från plattan. Var noga med att hålla lysates på is för att minimera proteas aktivitet
- Spin cell lysates i 15 minuter vid 4 ° C i en bänkbaserade mini-centrifugera vid toppfart (15,000 xg).
- Pipettera supernatanten i ett nytt rör. Kasta pelleten.
- Analysera protein nivåer och fortsätta med immunoprecipitation.
6. Förbereda Immuno-magnetiska Nederbörd Pärlor
OBS: Detta steg startas normalt direkt efter börjar 2 timmar crosslinking inkubation.
- Kombinera 30 mikroliter av Dynal immunomagnetic pärlor, 500 mikroliter av IP Buffer (1x buffert A + 0,1% Triton X-100) och lämplig mängd antigen-specifik antikropp för att screwtop mikrocentrifugrör. Förbered antikropp-fri och icke-specifik rör antikropp för negativa kontroller. Lämplig mängd antikroppar bör bestämmas utifrån individuella antigener under olika experiment. Etikett alla IP-rör.
- Låt IP-rören för att inkubera i en slut-over-end-rocker i rumstemperatur i två timmar. Alternativt inkubera IP-rör med antikroppar natten vid 4 ° dagen före crosslinking.
- Efter inkubation, göra en snabb 10 andra mini-centrifugering för att samla in kulorna i botten av röret.
- Skjut rören i den magnetiska hållaren, som kommer att dra det magnetiska kulor bort från botten av röret. Med pärlor på ett säkert sätt ur vägen, kan du nu enkelt tvätta bort alla obundna antikroppar.
- Använd en liten bar aspirator spets som en gel lastning tips eller P200 tips att ta bort inkubation buffert och alla obundna antikroppar. Så snart inkubationen volymen avlägsnas lägga i 1 ml IP-buffert.
- Cap röret försiktigt återsuspendera pärlor och inkubera alla IP-rör i rumstemperatur i 5 minuter med end-over-end-rotation.
- Upprepa 5 minuters tvätta steg (steg 6,3 till 6,6) en gång med en ny milliliter av IP-buffert.
- IP-rör kan finnas kvar i den sista tvättningen inkuberingen tills tvärbunden lysat är redo att läggas till i pärlor.
7. Inkubera Tvärbunden lysat med Immuno-magnetiska kulor
- Efter den sista tvättningen spin immuno-magnetiska kulor ner i en mini-centrifug i 10 sekunder. Fortsätt sedan att glida i rören i den magnetiska hållaren.
- Återigen, med en liten bar strävan spets, ta bort inkubationen volymen från röret. Tillsätt omedelbart 500 mikroliter av tvärbunden cell lysat (förutsatt lysat vid 1 mikrogram / ml) till rör som innehåller immuno-magnetiska kulor. Om du kommer att använda peptid konkurrens som en negativ kontroll, bör en lämplig mängd peptid tas med på denna punkt. Tidigare försök bör utföras för att fastställa lämpliga villkor peptid konkurrens. Alternativt kan du vill ha lysat gratis immuno-magnetiska kulor som negativ kontroll. I detta fall omedelbart lägga 500 mikroliter av lysat Buffer (1x buffert A + 0,5% Triton X-100) + Komplett med immuno-magnetiska kulor.
- Försiktigt resuspendera kulorna. Återsuspenderade pärlor bör inkuberas vid 4 ° i en slut-over-end-rotation för 2 timmar.
8. Tvätta Obundet lysat från Pärlor
- När lysat har haft tillräckligt med inkubationstid, göra en snabb 10 sekunders snurra i en mini-centrifug. Skjut sedan rör i den magnetiska hållaren. Den magnetiska hållaren bör hållas i ett isbad för resten av försöket.
- Använd en liten bar aspirator tips, ta bort alla obundna lysat. Omedelbart efter alla obundna lysat bort Tillsätt 1 ml IP-buffert.
- Cap röret och försiktigt resuspendera kulorna.
- När pärlorna är återsuspenderade upprepa pärla pelletering steg (8,1).
- Återigen aspirera av alla av inkubationstiden volym och omedelbart tillsätt 1 ml av IP-buffert, sedan locket på röret.
- Försiktigt resuspendera pärlor i IP-bufferten. Inkubera återsuspenderade pärlor i 5 minuter vid 4 ° med end-over-end gunga.
- Upprepa pärla tvättsteg (8,4 till 8,6) fyra gånger.
9. Denaturera Prov och inhämtar från Pärlor
- Efter alla av den immunmodulerande magnetiska nederbörd rör har tvättats, åter sediment kulorna (8,1) och rör glida in imagnetisk hållare.
- Proteiner bunden till immuno-magnetiska kulor avlägsnas i denaturering villkor. Sug bort den sista tvättningen IP-buffert och ta bort IP-röret från den magnetiska hållaren.
- Lägg 1x Buffert Gel provet till IP-röret ovanför pärlan pelleten poolen kulorna längst ner i röret igen. Mängden prov buffert beror på hur väl storleken på gelen som ska användas. Du kan behöva knacka försiktigt i botten av röret för att få alla pärlor återsuspenderade i gelen Sample buffert.
- Upprepa denaturering (9,2 till 9,3) för varje IP-rör.
- Immuno-magnetiska kulor suspenderade i gel Exempel buffert sedan värmas vid 75 ° C i 5 minuter för att slutföra denatureringsprocessen.
- När provet har denaturerats den kan köras på en SDS-PAGE gel för Western blotting. Tömda Immuno-magnetiska kulor kan återanvändas pelleterat genom centrifugering och tas bort från provet med den magnetiska hållaren.
10. Eluering av Tvärbunden komplex med Antigen peptider (Immunoaffinity Chromatography).
- Efter alla av den immunmodulerande magnetiska immunoprecipitation rör har tvättats, åter sediment kulorna (8,1) och rör skjut in den magnetiska hållaren. Aspirera supernatanten och tillsätt 10 ìl av buffert A kompletteras med antigen peptid som erkänns av antikropp som används för immunoisolation av protein komplex. Du bör testa koncentrationen varierade från 10 till 200 mikroM för effektiv eluering.
- Inkubera pärlor för 2 h vid 4 ° C.
- Sätt pärlor i den magnetiska monter och försiktigt återfå 10 mL elueras material. Spara den här supernatant.
- Snabbt tvätta pärlor med buffert A och kassera tvätt. Spara pärlor.
- Lägg Buffert Gel prov till den sparade supernatanten och pärlor till en koncentration av 1X. Inkubera dessa rör vid 75 ° C i 5 minuter.
- Analysera pärlor och peptid eluatet med SDS-PAGE. Eluatet ska vara fri från IgG både protein fläck av SDS-PAGE eller immunoblots (Figur 1B). Detta material utan IgG är lämplig för masspektrometri.
Figur 1. Isolering av AP-3 interagerande proteinkomplex och membranproteiner. HEK293-celler (A) eller PC12 celler (B) behandlades antingen i närvaro av kontrollen över fordonet (DMSO, udda körfält Fig. 1A) eller DSP (även körfält bild. 1A eller alla körfält i Fig. 1B). Förtydligat extrakt inkuberades antingen med pärlor ensam (bild 1A, Lanes 3-4), transferrin antikroppar receptor (Fig. 1A, Lanes 5-6), eller AP-3 δ antikroppar (bild 1A, Lanes 7-10, Fig. . 1B, körfält 1-10). Immunkomplex var elueras med SDS-PAGE prov buffert (Fig. 1A), buffert En ensam eller (Fig. 1B, körfält 1-2), eller buffert En kompletteras med stigande koncentration av δ antigen peptid motsvarande aminosyror 680 710 mänskliga δ-adaptin (NCBI: AAD03777; GI: 1.923.266) (Fig. 1B, körfält 3-10). Denna peptid binder δ antikropp. Efter peptid eluering var supernatanterna (S) och pärlor (B) analyseras av immunoblot (bild 1B). AP-3, som upptäcks med antikroppar mot δ, β3 och σ3 subenheter, coprecipitates med följande lösliga faktorer: clathrin tung kedja (CHC), den BLOC-1 subenhet pallidin och HUMLE komplexa subenheten vps33b, samt den membranproteiner fosfatidylinositol-4-kinas typ II alfa (PI4KIIα) och zink transportör 3 (ZnT3). Notera avsaknaden av IgG mus tunga kedjor i peptiden elueras supernatanten i bild. 1B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DSP, ett membran som släpper igenom, kemiskt reduceras crosslinker med en spacer arm av 12 A används för att stabilisera transienta proteininteraktioner 1,2,3,4. Här har vi exemplifierat denna strategi med adaptern komplexa AP-3 ett lösligt protein komplex som känner igen och sorterar membranproteiner i blåsor från endosomes 5. AP-3 binds selektivt till zink transportör ZnT3 och lipid kinas fosfatidylinositol-4-kinas typ II alfa men inte transferrin receptor 1,4,6. Vi expanderade dessa observationer till identifiering av en AP-3 proteininteraktioner nätverk av membranproteiner och cytosola faktorer genom masspektrometri 1. Låg bakgrund immuno-magnetiska nederbörd följer crosslinking att identifiera samverkande proteiner. Dessutom en publicerad katalog av proteiner som binder icke-selektivt till magnetiska kulor ger en första passage eliminering av icke-specifikt protein isolering och identifiering av masspektrometri 7. DSP använder amin-reaktiv estergrupper länka primära aminer som lysines eller aminosyran ändstationen av proteiner. Vid denaturering villkor, är DSP-molekylen klyvs på mitten och lämnar kort kemiska grupper på sammanlänkade aminosyror. För vissa antigener finns det en minskning i immunreaktivitet signaler genom immunoblot när man jämför samma protein laster mellan DMSO-kontroll och DSP behandlade cellerna (Figure1A). Det är möjligt att denna minskning beror på minskad antikroppar affinitet till DSP ändrade lysines. Bortsett från dessa sällsynta fall, ökar användningen av DSP kemiska crosslinking förmågan att upptäcka nära samverkande membran-associerade proteiner.
Proteiner eller protein komplex perifert i samband med cytosoliskt bipacksedel membran, till exempel AP-3 är lokaliserade till slemhinnor vid normal inkubation temperaturer på 37 ° C. Men i rumstemperatur på 15-20 ° C AP-3 komplex långsamt omfördelar till cytosolen. Således, för att fånga samspelet mellan AP-3 och membran-associerade proteiner, måste den inre temperaturen i dessa celler att snabbt kylas till 4 ° C. Det bästa sättet att åstadkomma detta är att 1) har alla buffertar inkubera i ett isbad innan du tar bort celler från 37 ° C inkubator, 2) att omedelbart avlägsna alla varma material från plattan av celler och ersätta med iskallt buffert, och 3) för att hålla cellerna upphängd på ett isbad för hela den crosslinking experimentet.
DSP är inte lösliga i vatten och på så sätt värmer PBS / Ca / Mg-lösning till 37 ° C före tillsats av DSP / DMSO lösning är att rekommendera. Eftersom cellerna behöver för att hålla en temperatur på 4 ° C, bör DSP crosslinking lösningen placeras i ett isbad När DSP är helt solubilized. Om DSP inte är helt solubilized stora mängder fällning bildas som lösningen kyls (en liten mängd nederbörd är normalt). Om en stor mängd nederbörd uppstår, prova att värma lösningen till 37 ° C för hela lösningsgörande och Återkylning. Om DSP upprepade gånger faller ut ur lösningen, kan du behöva för att förbereda nya crosslinking lösning. Den snabba avlägsnandet av DSP från lösningen på grund av ofullständig lösningsgörande ska inte förväxlas med den långsamma bildandet av ett kristallint skikt som visas i brunnar DSP behandlade cellerna. Förekomsten av denna DSP kristallina skikt påverkar inte bryggbindningen reaktion i cellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health till VF (NS42599 och GM077569).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | P4417 | Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM |
| Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22585 | Moisture sensitive, store in air tight container 4°C |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG | Invitrogen | 110.31 | Beads are also available as sheep anti-rabbit |
| Dyna-Mag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
References
- Salazar, G. Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells. J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate. J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).
- Xiang, C. C. Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling. Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).
- Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic. Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).
- Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery. J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).
- Salazar, G. The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation. Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).
- Trinkle-Mulcahy, L. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
