Summary
Tomate Analyzer (TA) quantifica os atributos de duas formas tridimensionais e cor de uma forma reprodutível e preciso. Um procedimento passo-a-passo para a obtenção de imagens digitalizadas de alta qualidade de frutos de tomate, análises morfológicas e cor das imagens e aplicações diversas usando os dados gerados por este software são descritos.
Abstract
Medir a morfologia de frutos e as características de cor de culturas vegetais e frutas de forma objetiva e reprodutível é importante para análises detalhadas fenotípica dessas características. Tomate Analyzer (TA) é um programa de software que mede 37 atributos relacionados a duas dimensões da forma em um 1,2 maneira semi-automática e reprodutível. Muitos desses atributos, tais como ângulos nas extremidades distal e proximal do fruto e áreas de recuo, são difíceis de quantificar manualmente. Os atributos são organizados em dez categorias dentro do software: Medição Basic, Índice de Forma Frutas, blockiness, Homogeneidade, Shape End Proximal Fruit, Shape extremidade distal Frutas, Assimetria, excentricidade Interna, Seção latitudinal e Morfologia. A última categoria não requer conhecimento prévio nem noções pré-determinada dos atributos forma, a análise morfométrica de modo oferece uma opção imparcial que pode ser melhor adaptado para high-throughput análises do que a análise de atributos. TA também oferece a aplicação do Teste de Cor, que foi projetado para coletar medidas de cor a partir de imagens digitalizadas e permitir a digitalização dispositivos a ser calibrado com padrões de cores 3.
TA fornece várias opções para exportar e analisar atributo forma, morfométrica, e os dados de cor. Os dados podem ser exportados para um arquivo excel em modo de lote (mais de 100 imagens de uma só vez) ou exportados como imagens individuais. O usuário pode escolher entre a saída que exibe a média de cada atributo para os objetos em cada imagem (incluindo desvio padrão), ou uma saída que exibe os valores de atributo para cada objeto na imagem. TA tem sido um instrumento valioso e eficaz para identificando e confirmando tomate fruta forma Quantitative Trait Loci (QTL), bem como realizar análises em profundidade do efeito de genes de frutas chave forma na morfologia da planta. Além disso, a AT pode ser usada para classificar objetivamente frutas em categorias diversas formas. Por último, o formato do fruto e traços de cor em outras espécies de plantas, bem como órgãos de outras plantas, como folhas e sementes podem ser avaliadas com TA.
Protocol
Tomate Analyzer software (TA) é projetado para reconhecer objetos de um determinado tamanho e resolução de imagem, medida em pontos (pixels) por polegada (dpi). O software determina automaticamente os limites de frutas em uma imagem digitalizada. O limite do objeto é determinada através de contorno traçado, o que resulta em uma lista de pontos adjacentes descrevendo a fronteira de um objeto em uma imagem. Todas as medições forma do fruto são calculados com base nos limites. O teste de cores módulo "Tomato Color Test Analyzer" é projetado para quantificar os parâmetros de cor dentro dos limites reconhecidos pelo software. As medições de cores são baseadas no espaço de cores RGB: R (vermelho), G (verde) e B (azul). Os valores médios RGB para cada pixel é tomado por módulo de teste de cores e depois traduzido para o espaço de cor CIELAB, que usa L *, a *, b * para descrever a cor de uma forma que aproxima a percepção visual humana. O módulo de teste de cores calcula Hue e descritores de cor Chroma baseado em um * e b *.
Um protocolo passo a passo é descrito para digitalização de tomate e análise semi-automática subseqüente de morfologia e atributos de cor usando o pacote de software TA. O protocolo é dividido em oito etapas: coleta de Imagem 1) Seleção e preparação de material vegetal, 2), 3) A instalação do software, 4) análise de imagem e de calibração para o teste de cores TA, 5) ajuste manual de atributos, 6) pelo usuário configurações definidas, 7) Salvamento e exportação de dados, e 8) Exemplos de análise de dados.
1. Seleção e preparação de material vegetal
- Fruta deve estar limpa e seca.
- Fruto carnudo não deve ser madura, porque amolecimento pode causar deformação forma ao cortar a fruta.
- Cortar a fruta com uma faca serrilhada afiada ou uma lâmina de barbear nova. Dependendo do tipo de análise e os atributos a serem avaliados, frutas devem ser cortadas longitudinalmente ou transversalmente através do centro. Análise de cor pode ser aplicado a longitudinalmente ou cortados transversalmente fruta, bem como outras seções projetado para destacar características específicas.
- Secar a parte interna do fruto por blotting com toalhas de tecido ou papel, se a fruta é muito suculenta.
2. Coleção de imagens
- Corte de frutas e colocar no scanner com o lado cortado para baixo. Coloque uma régua acima e uma etiqueta abaixo da fruta. A régua é utilizada para verificar se a resolução de digitalização correto foi selecionado, e é importante para a medição precisa dos atributos da fruta. Para high-throughput análise dos dados, é essencial para fazer a varredura de frutas a partir de apenas uma planta (ou genótipo) em um tempo e fazer a varredura de frutas que é tanto no sentido longitudinal ou transversalmente cortados, mas não uma mistura de ambos na mesma varredura. Frutos local juntos, mas evitar tocar fruta adjacentes. Também evitar grandes espaços vazios entre os frutos do scanner. Se os objetos estão muito distantes um do outro, a imagem deve ser manipulada usando software de imagem, como Adobe Photoshop ou GIMP antes da análise com TA.
- Desde software TA usa a resolução de imagem para medir com precisão o tamanho, a seleção adequada da resolução de digitalização é importante para análise posterior.
- Como regra geral, se os objetos estão entre 1 e 8 cm, scan em 200 ou 300 dpi (pixels / inch). Se os objetos forem> 8 cm, digitalização a 100 dpi. Para objetos muito pequenos (<1 cm), tais como sementes, digitalização a 750 dpi ou superior. Quando a análise do lote é planejadas (ver abaixo) eo tamanho dos frutos não é altamente variável entre diferentes plantas, é conveniente para selecionar uma configuração de resolução do scanner para obter todas as imagens a serem coletados para o mesmo experimento.
- Para o teste de cores, defina a resolução do scanner de 200 dpi, se os frutos são <8 cm. Se os frutos são> 8 cm, digitalização a 100 dpi. Além disso, defina o tamanho da imagem de saída em maior número de cores disponíveis no scanner.
- Objetos devem ser verificados com um fundo preto ou muito escuro para evitar sombras que irá interferir com a análise. Um fundo escuro pode ser obtida colocando uma caixa de papelão sobre o scanner de modo que toda a luz é restrito a partir do ecrã. Se um fundo branco é utilizado, TA não funcionará porque o aplicativo é otimizado para o uso de um fundo escuro.
- A imagem deve ser cortada após a verificação inicial (antes de salvar a imagem) para evitar grandes espaços vazios. Se a imagem não será cortada nesta fase, deve ser cortado usando o software de imagem, como Adobe Photoshop ou GIMP antes da análise com TA.
- Para as análises de cores, o scanner precisa ser calibrado se o usuário tem a intenção de traduzir os valores RGB para o universal L *, a * e b * escala. A verificação do verificador de cor (Figura 1) deve ocorrer antes ou durante a digitalização dos frutos. O verificador de cores digitalizadas devem ser salvos na mesma pasta que as imagens de frutas. Calibração do scanner é necessário porque scanners diferem na forma como a captura de cor data ea fonte de luz pode mudar ao longo do tempo com o uso repetido.
- Obtenção de padrões de cores e digitalização. Cor normas devem ser escolhidos com base na ampla gama de cores observadas na safra de interesse. Para este exemplo, nós escolhemos um gráfico rendition padrão de 24 cores (ColorChecker, X-Rite, Grand Rapids, MI, Figura 1). Digitalizar o verificador de cor como você faria a varredura dos frutos. Calibração do scanner é explicado na secção 4.7.
- Guardar a imagem digitalizada como um arquivo JPEG.
Nota: Tenha cuidado e preciso ao colocar os objetos no scanner durante a etapa de coleta de imagem. Quanto melhor os objetos estão alinhados, o ajuste menos manual será necessária quando se analisa a fruta em TA. Exemplos de imagens de qualidade baixa e alta são mostrados na Figura 2.
3. Instalação do software
- Tomate Analyzer (TA) versão 2.2.0.0 pode ser baixada http://www.oardc.osu.edu/vanderknaap/tomato_analyzer.htm . O tomate Manual do Usuário Analyzer eo tomate Analyzer manual de teste de cores também estão disponíveis a partir deste site.
- TA requer um sistema operacional Windows (versão 2000 ou superior).
4. Análise de imagem e de calibração para o teste de cores TA
- A pasta com as imagens devem ser colocados no disco rígido e não no "Meus Documentos" ou pasta em um servidor remoto. Caso contrário, TA não vai salvar as imagens ajustadas na mesma pasta que as imagens originais. Garantir que as imagens ajustadas com a extensão. Tmt estão na mesma pasta que o original. Jpg (veja o passo 6.1.1).
- Lançar o programa TA como faria com qualquer outra aplicação de software com um duplo clique sobre o ícone.
- O usuário deve definir o dpi e unidades de medida para as configurações adequadas, selecionando "Scanner DPI" do menu "Configurações". A configuração de dpi deve ser o mesmo que o arquivo de imagem para que a medição do tamanho (altura, largura, perímetro, área) são precisos. O "Unidades usado" na caixa de diálogo determina as unidades (cm, mm, em, ou pixel) para a saída de dados. Na mesma caixa de diálogo, o brilho pode precisar de ser ajustadas quando os objetos são relativamente escuro.
Nota: O DPI e Unidades também pode ser ajustada depois de fazer ajustes manuais ou depois de análise de imagem. - O usuário pode selecionar os atributos a serem medidos, selecionando "Medição Saved" do menu "Setting". Isto pode ser feito a qualquer momento durante ou após a análise. Os atributos são agrupados em dez categorias (ie Medição Basic, Índice de Forma Frutas, blockiness, homogeneidade, Shape End Proximal Fruit, Shape extremidade distal Frutas, Assimetria, excentricidade Interna, Seção latitudinal e Morfologia). Atributos individuais ou um grupo de medição inteira pode ser selecionada ou não, clicando sobre o grupo ou atributo. Todos os atributos de um grupo de medição pode ser mostrado, clicando no "+". Os atributos selecionados são exibidos por categoria na janela no canto inferior direito da tela, como mostrado na Figura 3.
- Para começar, clique em "Abrir imagem" e selecione o arquivo de imagem a partir da caixa de diálogo pop-up. A imagem selecionada será exibida na janela da esquerda.
- Para analisar a imagem aberta, clique no botão "Analisar". Quando terminar, o perímetro de cada fruta em destaque com uma linha amarela e os dados serão exibidos na janela de dados inferior direito. O software vai automaticamente desmarcar objetos muito grandes ou pequenas, como uma régua ou o rótulo. Os objetos desmarcada será destacada com uma linha azul. Frutas adicionais podem ser desmarcada pelo botão direito sobre sua imagem. Somente os itens descritos em amarelo será exibido na janela de dados e exportado (Figura 3). Itens descritos em azul não será incluído nas análises. Objetos individuais são exibidos na janela superior direita pela esquerda, clicando sobre eles com o mouse.
Nota: Os dados do módulo de teste de cores não são mostrados na janela inferior dados corretos. - Analisar o verificador de cor para a análise de cor.
- Verificador de cor e coleta de L *, a *, b * valores. Abra a imagem digitalizada verificador de cor e analisar como descrito para os frutos. Certifique-se de TA reconhece cada patch como um objeto de análise (quadro amarelo). Se você estiver usando um verificador de cor padrão, o software pode não ser capaz de reconhecer os trechos mais escuros. Estas cores não serão incluídos na calibração. No menu Configurações, selecione "Test Color". A caixa de diálogo irá aparecer. Certifique-se que os valores de correção são definidos a 1 para a inclinação (caixas à esquerda) e 0 para o y-intercepto (caixas de direita). Valor mínimo de azul deve ser definido para 0, e os parâmetros 1 e 2 podem ser ignorados. Clique no botão Analisar dentro da caixa de diálogo de cor do teste. Uma nova janela aparecerá para salvar ªde saída e como uma "CSV" documento que pode ser aberto no Excel. Especificar o nome eo diretório para o arquivo de dados. O arquivo de saída de dados irá conter os valores RGB; L *, a *, b * valores e cálculos de matiz e croma para cada amostra de cor.
- Determinar valores de correção para calibração. Plot do L *, a *, b * valores para cada amostra de cor em relação aos valores colorímetro para L *, a *, b * e que estão disponíveis a partir do fabricante do verificador de cor ou na Tabela 1. Determine a equação de regressão e gravar a inclinação e intercepto y para cada parâmetro. Na caixa de diálogo, digite o inverso do coeficiente angular eo inverso do sinal do valor do intercepto-y de L *, a * e b *. Estes valores são usados como valores de correção para o "Color Test" configurações.
- Teste de cores permite ao usuário definir dois parâmetros que o relatório da proporção (%) dos pixels que caem em intervalos especificados de valores de matiz escolhido. Para a análise de tomate, por exemplo, os valores inferior e superior para o parâmetro 1 são 70 e 100, respectivamente, que correspondem a cor de carne indesejáveis amarelo e verde-amarelo. Os valores inferior e superior para o parâmetro 2 são 0 e 50 e correspondem à cor desejada vermelho. Salve as configurações para esses valores. Estes valores serão aplicados a todas as imagens que estão sendo analisados até que o programa é fechado. Para imagens digitalizadas, selecione a opção "2 ° C Iluminante" opção. O "iluminante D65 10 °" opção só é aplicada a imagens adquiridas na luz natural.
- Visualização de resultados (ver Figura 3): Cada linha de dados na janela de dados inferior direito corresponde a um determinado objeto na imagem. Os dados são exibidos na mesma ordem em que os objetos na imagem. A primeira linha exibe os valores para o objeto no canto superior esquerdo ea última linha de dados exibe os valores para o objeto no canto inferior direito da imagem. Clique em uma linha para exibir o fruto correspondente na janela superior à direita. Como alternativa, clique em uma fruta e da linha de dados correspondente será realçado. Ao clicar na guia atributo na janela inferior direito, é possível ver como o atributo está sendo medido para cada fruta particular. Por exemplo, clicando no ângulo de extremidade distal, o ângulo medido pelo software do fruto na janela da esquerda será exibida. Este recurso é muito útil quando identificar objetos que requerem ajuste manual para mais uma medição precisa.
A Figura 4 mostra uma imagem a analisar com módulo de teste de cores. No entanto, os resultados não são vistos na janela de dados. Os dados só podem ser acessados em um arquivo Excel após a análise é salvo.
5. Ajuste manual de atributos
Às vezes o limite da fruta e as extremidades proximal e distal não são encontradas corretamente pelo TA. Além disso, se frutos são colocados em um ângulo no scanner, a imagem deve ser ajustada para obter medições corretas. Essas e outras características podem ser corrigidas através de ajuste manual das imagens após a análise inicial. Os ajustes disponíveis aparecem sob o botão de menu "Rever" e incluem: Girar, limite, extremidade proximal, extremidade distal, Auto-rotação, Ajuste Ellipse, Ajuste Protrusão Distal, Ajuste de Fronteira pericarpo, Default Boundary pericarpo.
Nota: Se os ajustes devem ser feitos, primeiro ajuste o limite, seguido pela rotação. Todos os outros ajustes podem ser feitos em qualquer ordem a seguir estes dois ajustes. Um ajuste selecionada no menu Rever permanece selecionado até que um ajuste diferente é escolhido. Isto permite ao usuário executar o mesmo ajuste em uma seqüência de fatias, clicando na imagem fatia e clicando no botão Editar. Abaixo, ajustes manuais em atributos diferentes frutas são detalhados.
- Limite
- À esquerda, clique sobre a fruta na janela da esquerda. Ele aparecerá na janela superior direita.
- Clique na seta ao lado do "Rever" e selecione "Limite" da lista suspensa na janela superior direito. Selecione o local de contorno a ser modificado pela esquerda clicando sobre o ponto de partida e ponto final do limite incorreto. Como resultado, a fronteira delimitada serão removidos.
- Para adicionar um novo limite, clique esquerdo do ponto inicial em direção ao ponto final. Continue a clicar para seguir o contorno desejado. Botão direito do mouse irá desfazer uma modificação anterior. Várias modificações pode ser desfeita por cliques consecutivos direita.
- Para confirmar o novo limite, pressione a tecla "Enter". Caso contrário, pressione a tecla "Esc" para cancelar essa operação.
- Clique em "Boundary Reset" para voltar para a configuração de limite original.
- Girar. Este recurso é utilizado quando um objeto não é totalmente vertical.
- Clique sobre o fruto apropriado na janela esquerda. Ele aparecerá na janela superior direito.
- Clique na seta ao lado do "Rever" e selecione "Rotate"a partir da lista suspensa.
- Um eixo será exibido na janela superior direito. Arraste o quadrado verde no final do eixo e os frutos vão girar em conformidade.
- Dê um duplo clique dentro da janela ou pressione a tecla "Enter" para terminar.
- Clique em "Rotation Reset" para voltar ao alinhamento original.
- Ajuste final proximal. Se houver um erro na posição da extremidade proximal, as medições derivados deste recurso será incorreto. Selecione uma fruta que requer ajustes para que ele aparece na janela do lado direito. Em seguida, selecione a opção "Proximal fruto final forma" guia eo "Proximal ângulo de micro ou macro" na seção de saída de dados abaixo da fruta selecionada. Os ângulos proximal agora será mostrado para cada fruta na imagem à esquerda. Desta forma, os ângulos que parecem fora do comum podem ser identificados. Para alterar a posição da extremidade proximal, siga estes passos:
- Clique sobre o fruto desejado, na janela esquerda. Ele aparecerá na janela superior direita.
- Clique na seta ao lado do "Rever" e selecione "End Proximal" da lista suspensa.
- Na janela superior direito, clique e arraste o indicador de vértice para a posição correta.
- Dê um duplo clique ou pressione a tecla "Enter" para terminar.
- Ajuste extremidade distal. A posição da extremidade distal do objeto também pode ser alterado manualmente. Localize com eficiência as frutas que precisam de ajustes extremidade distal, siga o mesmo procedimento para o final proximal.
- Clique sobre o fruto desejado, na janela esquerda. Ele aparecerá no canto superior direito.
Clique na seta ao lado do "Rever" e selecione "End Distal" da lista suspensa. - Na janela superior direito, clique e arraste o indicador de vértice para a posição correta.
- Dê um duplo clique ou pressione a tecla "Enter" para terminar.
- Clique sobre o fruto desejado, na janela esquerda. Ele aparecerá no canto superior direito.
- Protrusão extremidade distal. Esta função permite ao usuário definir os pontos finais no limite da ponta.
- Sob o título "End Distal Fruit Forma", selecione na coluna denominada "Protrusão extremidade distal" e selecione o objeto para ajustar.
- Clique na seta ao lado do "Rever" e selecione "Ajustar Protrusão Distal" a partir do menu suspenso.
- Arraste os pontos que aparecem nas posições desejadas ao longo da fronteira.
- Pressione a tecla Enter para terminar. Uma linha aparecerá mostrando o corte da área de ponta e recalcular a área de ponta. Os resultados aparecerão na coluna Distal End Protrusão. Se a área de ponta não está na posição desejada, selecionando "Protrusão Redefinir Distal" sob a "Rever" botão irá redefinir os pontos a suas posições iniciais. Se uma área de ponta é encontrado, mas não deve existir, selecionar "Eliminar Protrusão Distal" do "Rever" botão irá mover os pontos para a parte inferior do fruto, resultando em um valor de 0,0 para o "Fim Distal Protrusão" coluna.
- Auto-rotação. Esta função é especialmente desenvolvido para sementes de tomate, para que possam ser automaticamente alinhado com a extremidade pontiaguda na mesma direção. Neste momento, auto-rotação não funciona em outros objetos, como frutas.
- Ajuste elipse. Esta função permite ao utilizador redimensionar e / ou mover a elipse interna para definir áreas de frutas interna. Este atributo é usado para a função de excentricidade Interno e atributo Fruit Index Forma Interna de TA.
- Selecione a guia excentricidade Interna, em seguida, selecione qualquer uma das colunas na guia. Selecione um "tamanho da elipse padrão" do menu "Configurações".
- Selecione um objeto e clique em "Rever" botão. Selecione "Ajustar Ellipse" a partir do menu suspenso.
- Dois pontos irão aparecer representando os pontos superior e esquerda da elipse. Movê-los ambos redimensiona e re-centers da elipse com relação aos dois novos pontos.
- Uma vez que estes pontos foram definidos para as suas posições desejadas, pressione a tecla Enter. A elipse será redesenhado. Se a posição é aceitável, pressione Enter novamente e os valores nas colunas serão atualizadas.
- Se a elipse interna precisa ser movido sem ser remodelada, clique no centro dos objetos, onde os pontos foram. Duas linhas e três pontos verde aparecerá. Mover o ponto posicionado aproximadamente no centro do fruto para um novo local para mover a elipse sem redimensioná-la.
- Pressione Enter para terminar.
- Ajuste de limite pericarpo. Esta função permite ao usuário definir a região do pericarpo e precisa ser ajustada quando pericarpo área "e" espessura pericarpo "são selecionados no" latitudinal guia da seção ".
Nota: para as frutas que são mais maduros, pode ser difícil ou impossível distinguir o pericarpo do restante da fruta.- Selecione um objeto e clique em "Rever" drop down menu. Selecione "Default limite pericarpo" e definir o padrão que melhor se encaixa no pericarpo.
- Para ajustes adicionais, selecione "Ajustar pericarpo fronteira" do "Revisar" no menu suspenso.
- Na janela superior direito, selecione o local limite pericarpo que precisa ser modificado. Isto é conseguido pela esquerda clicando sobre o ponto de partida e ponto final do limite incorreto. Como resultado, a fronteira delimitada serão removidos. Para o melhor resultado, a seção menor possível de fronteira devem ser selecionados a qualquer momento.
- Para adicionar um novo limite, clique esquerdo do segundo ponto de volta para o primeiro ponto. Continue a clicar para seguir o contorno desejado. Botão direito do mouse irá desfazer uma modificação anterior. Várias modificações pode ser desfeita por cliques consecutivos direita.
Nota: Muitas modificações limite pericarpo pode resultar em falhas do programa. - Para confirmar a nova fronteira, pressione a tecla "Enter". Caso contrário, pressione a tecla "Esc" para cancelar essa operação.
- Selecione "Boundary pericarpo Reset" para retornar o limite à sua posição original.
- Para a análise de cor, quando o limite da carne não está na borda da imagem de frutas (por exemplo, um corte transversal no ombro de frutas, mostrando a pele do fruto acima do corte transversal como mostrado na Figura 4), o usuário precisa abrir o "Color Test" caixa de diálogo sob o menu "Configurações". Nesta caixa de diálogo, o valor mínimo azul precisa ser definido para 30 e salvos. Se os frutos são <3 cm, defina o valor mínimo de azul para 20. Este valor pode precisar ser ajustado se TA tem dificuldade em encontrar os limites corretos.
6. Configurações definidas pelo usuário
Para alguns atributos, o usuário precisa selecionar as configurações em que a medição deve ser feita. Isto pode ser feito antes ou depois da análise e vai depender se um experimento deve ser repetido com as mesmas configurações como foram usadas anteriormente ou se o usuário quer fazer análises exploratórias, a fim de definir a configuração adequada para a nova análise.
- Definição de blockiness extremidade distal e proximal. Blockiness é calculado como a relação entre a largura na proporção seleccionados pelo utilizador da altura mais próxima à extremidade distal / proximal do fruto para a largura média (Figura 5A). Isto permite ao usuário selecionar ou alterar a localização do objeto onde a medição é feita. As posições blockiness superior e inferior pode ser alterado, inserindo um novo valor na "posição blockiness" sob o botão "Definição".
- Definição de ângulos de micro e macro. Essas configurações são usadas para calcular os ângulos em várias posições a partir das extremidades do fruto (Figura 5B). O ajuste macro é normalmente usado para os ângulos de 5 a 40% ao longo do limite e da definição de micro é usado para 2 a 10% ao longo da fronteira.
- Número de pontos morfométricos. Essa função localiza os pontos ao longo da fronteira de cada objeto na imagem carregada. As extremidades distal e proximal são usados como pontos de referência para cada objeto na imagem. O número de pontos medidos ao longo da fronteira pode ser selecionado por "n º de pontos morfométricos" sob o menu "Configurações". Entre 4 e 30 pontos podem ser selecionados. O software irá dividir automaticamente o número de pontos selecionados pela metade e uniformemente distribuí-los em cada lado do fruto entre as extremidades distal e proximal.
7. Poupança e exportação de dados
- Salvar dados
- Depois de ajustes manuais de análise de imagem e de imagem por TA, clique em "Fruit Salvar". Todas as informações atuais, incluindo ajustes manuais e objetos desmarcada, será salvo em um novo arquivo com o mesmo nome da imagem original e uma extensão de tmt. Cada vez que um arquivo é selecionado, o arquivo tmt salvo com o mesmo nome será automaticamente aberto porque está vinculado ao arquivo original. No entanto, o arquivo deve ser armazenado tmt na mesma pasta que o arquivo de imagem jpg (ver secção 4.1). Se o software não armazena os arquivos e tmt jpg na mesma pasta, mova a pasta de imagens para a unidade C.
- Para reverter para o arquivo de imagem original, sem que nenhum dos ajustes, basta apagar o arquivo tmt associados. Uma alternativa é selecionar "Analisar" e reanalisar a imagem original. Entretanto, esteja ciente de que qualquer tmt com o mesmo nome que a imagem continua a ser associada à imagem da próxima vez que o arquivo é aberto, a menos que, é claro, os ajustes são salvos em cima do arquivo tmt.
- Dados de exportação
- O usuário pode exportar dados para uma imagem individual, seleccionando o botão "Exportar". Os dados serão exportados para um arquivo do Excel e exibir os valores de atributo para cada fruto, a média eo desvio-padrão.
- TA aplicativo também pode exportar os valores dos atributos de duas ou mais imagens ("Batch Analysis" função).
- Para start-se a análise do lote, clique no "Open Image" botão.
- Selecione os arquivos de imagem a ser lote analisado. Forem selecionados vários arquivos usando o "Shift" ou "Ctrl" ao selecionar arquivos adicionais. Depois que os arquivos são selecionados, clique na tecla "Open".
- O usuário será perguntado para selecionar o tipo de saída da análise do lote: "Só Média", "Média e Desvio Padrão" ou "Medidas individuais por imagem". Um exemplo de dois modos de exportação é mostrado na Figura 6.
- Escolha um nome para o arquivo de Excel que será criado e clique em "Save" chave. O software irá abrir automaticamente os arquivos e iniciar a análise do lote. Se os arquivos de imagem tenham sido previamente analisados e salvos pela TA, os arquivos salvos. Tmt serão abertos para a análise do lote. Se os arquivos não tenham sido previamente analisados, o software irá realizar a análise de imagens sem ajustes manuais e deselections. TA pode realizar uma análise do lote de pelo menos 100 imagens de 600 dpi.
- Análise de lote para análise de cor. Abra o "Color Test" opção em menu de configuração. Confira a análise do lote e clique em Analisar. Uma nova janela será exibida para selecionar as imagens a serem analisadas. Na janela seguinte, especifique o nome eo diretório para o arquivo de dados. Clique em Salvar. O arquivo de saída conterá o nome de cada imagem (com base no nome do arquivo) e valores de cor média para cada fruto na imagem. Os parâmetros incluídos na saída são: parâmetro 1, o parâmetro 2, R, G, e os valores B, L luminosidade, *, a *, b * e valores, bem como os valores de matiz e croma. Módulo de teste de cor pode fazer uma análise de lote de até 100 imagens de frutas dependendo do hardware do computador s.
8. Exemplos de análise de dados
A saída gerada pelo TA pode ser usado para muitas aplicações. Em estudos genéticos, a saída é usado para detectar o formato do fruto QTL (Quantitative Trait Loci) em várias populações segregantes de cruzamentos entre diferentes variedades de tomate cultivadas (S. Lycopersicum) e as espécies selvagens S. pimpinellifolium adesão LA1589 1,4,5. TA também pode ser usada para classificar frutas em forma categorias 6 e analisar tomate descoloração cor do fruto, devido ao distúrbio fisiológico "ombro amarelo" 3. Além disso, o software tem sido utilizado para analisar outros órgãos da planta, como folhas e sementes 7 8,9.
9. Resultados representante
A saída de AT tem sido usado para aplicações mais variadas. Em estudos de fruta forma QTL, imagens de frutas (8 a 10 frutos por planta em uma única imagem) foram coletadas de um total de 96 a 130 plantas em cada população. Posteriormente, essas imagens foram analisadas pelo TA 4,5. Para detectar associação entre fenótipos e genótipos, análises QTL foram realizadas utilizando mapeamento por intervalo composto 10,11 e por multitraço mapeamento por intervalo composto para subconjuntos de atributos em cada população 12. Como resultado, muitas regiões do genoma de tomate formato dos frutos controle foram identificados. Algumas dessas regiões estavam presentes em várias populações, enquanto outros eram exclusivas de uma população. Enquanto alguns QTLs fruta forma (como ovate, sol e fs8.1) eram conhecidos de estudos de mapeamento anterior, vários outros loci foram recém-descobertas. No total, 17-36 QTLs controlando atributos forma do fruto foram detectadas em três populações segregantes 2,4.
Dados gerados pelo TA também tem sido analisados usando Análise de Componentes Principais (PCA). Em um estudo, quinze atributos de forma foram submetidos a PCA, e os três primeiros componentes principais (PC) foram posteriormente mapeados como traços. Os dados mostram que QTLs PC sobreposta com QTLs atributo que estavam contribuindo para a componente 4. Populações segregantes também foram usados para comparar os QTL identificados com Morfologia ao QTL identificadas com os atributos da forma. Novamente, a morfometria QTL foram mostrados para coincidir com o formato do fruto QTL controlando e atributos de tamanho em 93% dos 2 casos. Estes resultados mostram claramente a validade e reprodutibilidade dos dados produzidos pelo TA em analisar a morfologia dos frutos.
Outra aplicação da TA é a criação de um sistema de classificação de frutas de forma a identificar cultivares de tomateiro com base em medições de forma objetiva fruta. A coleção de germoplasma de ~ 350 adesões de tomate de origem diversa e morfologia de frutos foi avaliada. Cerca de oito frutos de cada planta foram digitalizadas e analisadas com TA. Dois sistemas de classificação existentes, IPGRI UPOV 13 e 14, foram avaliadas e comparadas utilizando comparações visuais com imagens de frutas em nossa coleção. Nós modificamos a classificação morfológica destes dois sistemas através da combinação de várias categorias e criando dois novos 6. O prcategorias oposed são obovóide plana, redondo, longo, retangular, elipsóide, coração e coração de boi. As oito novas categorias adaptadas do IPGRI 13 e 14 UPOV sistemas são mais visualmente distinguíveis, e foram testados usando medidas TA. A saída TA de 37 atributos de cada adesão foi submetido a PCA e Análise Discriminante Linear (LDA) para identificar as medidas que melhor definem cada categoria de forma de fruta, e também para avaliar com precisão como os atributos discriminador explicar a classificação visual de cada adesão. Uma possível aplicação deste sistema de classificação de frutas forma seria usar a saída do TA às adesões de cluster baseado em dados fenotípicos e identificar associações entre as categorias de forma diferente da fruta.
O módulo de teste de cores em TA foi comparado com medidas de cor feitas com um colorímetro (CR300) em um puras retrocruzamento população (IBC) resultante de cruzamentos entre S. cultivares de processamento lycopersicum 3. O * L, a *, b * e os valores do colorímetro foram comparáveis aos valores de cor obtidos a partir de três scanners diferentes com TA. No entanto, as diferenças entre os três scanners foram observadas devido a hardware, software, ou os valores não-padronizados RGB. Conseqüentemente, uma opção para inserir valores de correção foi implementada em teste de cores para permitir calibração do scanner. Em um estudo genético usando Teste de Cores de TA, a variação genética para a cor e uniformidade de cor foi significativamente maior do que quando esses valores foram obtidos a partir de um colorímetro. Essas diferenças são devido a parâmetros de cor TA medição de uma superfície inteira enquanto o colorímetro analisa apenas alguns pontos sobre a superfície. Por último, TA foi testado e foi capaz de analisar cor e uniformidade de cor em outras culturas como batata, pepino, melão, morango e 3.
Figura 1. Verificador de cor padrão para o módulo de teste de cores para calibrar os valores de cor obtido a partir de scanners diferentes e em momentos diferentes.
Figura 2. Imagens digitalizadas de alta qualidade são necessários para o bom funcionamento do TA. A) Um exemplo de uma imagem de baixa qualidade. TA tentará encontrar objetos em toda a imagem. Quando existem grandes espaços vazios, como mostrado aqui, TA podem não funcionar corretamente ou falhar. Algumas frutas não foram secos com papel absorvente, e o suco na tela do scanner irá impedir TA de reconhecer o limite de frutas correta. Além disso, quando a maioria das frutas são incorretamente orientado verticalmente, muitos atributos não serão calculados corretamente. Essas imagens de baixa qualidade vai desacelerar significativamente a análise da forma de fruta por causa da extensa ajustes manuais que terá de ser feita antes da análise. B) Um exemplo de uma imagem de alta qualidade. Os frutos são verticalmente orientada corretamente, perto espaçados, enquanto não tocar uns aos outros e seco com papel absorvente.
Figura 3. Captura de tela do software TA. A janela superior mostra os botões para vários instrumentos disponíveis (ou seja, a imagem abrir, salvar frutas, exportação de dados, o tamanho do ajuste, analisar e rever). O objeto na janela superior direito foi selecionada para ajustes manuais e os dados são exibidos na janela inferior direito. Os valores para esta fruta são destacados em cinza na janela de dados inferior direito. Os objetos descritos em amarelo na janela da esquerda serão incluídos nas análises enquanto objetos descritos no azul não serão incluídos nas análises.
Figura 4. Uma imagem usada para o Analisador de tomate - aplicação de teste de cores.
Figura 5. Configurações definidas pelo usuário. A) atributos blockiness. Posição superior é usado para calcular blockiness extremidade proximal e atributos triângulo. O ajuste para a posição superior determina onde X é medida (= 10% na figura). A posição mais baixa é usada para calcular blockiness extremidade distal e atributos triângulo. A configuração para Lower posição determina onde Y é medida (= 90% na figura). Os valores para essas posições iguais a porcentagem da altura da parte superior do fruto. B) atributos ângulo Macro. As linhas verdes representam porcentagem (= 20% na figura) ao longo do limite a partir do final (quadrado preto na figura) onde o ângulo será medido. O software irá determinar a inclinação usando + / - 5% do valor selecionado. Para os ângulos micro o software irá determinar a inclinação usando + / - 2% do valor selecionado.
Figura 6. Um exemplo da saída de dados obtidos com a ferramenta Export a partir da imagem mostrada na Figura 3. A) Saída exibindo os valores de atributo para cada fruto, a média eo desvio-padrão. B) Saída exibindo os valores do atributo média eo desvio-padrão de 10 variedades de tomate.
| * L | a * | b * | |
| 1 | 37,986 | 13,555 | 14,059 |
| 2 | 65,711 | 18,13 | 17,81 |
| 3 | 49,927 | -4,88 | -21,925 |
| 4 | 43,139 | -13,095 | 21,905 |
| 5 | 55,112 | 8,844 | -25,399 |
| 6 | 70,719 | -33,397 | -0,199 |
| 7 | 62,661 | 36,067 | 57,096 |
| 8 | 40,02 | 10,41 | -45,964 |
| 9 | 51,124 | 48,239 | 16,248 |
| 10 | 30,325 | 22,976 | -21,587 |
| 11 | 72,532 | -23,709 | 57,255 |
| 12 | 71,941 | 19,363 | 67,857 |
| 13 | 28,778 | 14,179 | -50,297 |
| 14 | 55,261 | -38,342 | 31,37 |
| 15 | 42,101 | 53,378 | 28,19 |
| 16 | 81,733 | 4,039 | 79,819 |
| 17 | 51,935 | 49,986 | -14,574 |
| 18 | 51,038 | -28,631 | -28,638 |
| 19 | 96,539 | -0,425 | 1,186 |
| 20 | 81,257 | -0,638 | -0,335 |
| 21 | 66,766 | -0,734 | -0,504 |
| 22 | 50,867 | -0,153 | -0,27 |
| 23 | 35,656 | -0,421 | -1,231 |
| 24 | 20,461 | -0,079 | -0,973 |
Tabela 1. L *, a *, b * valores para cada patch do verificador de cor (ver Figura 1). A fonte de iluminante D50 e foi o ângulo de observação foi de 2 °.
Discussion
Avaliação de alto rendimento e precisa da morfologia da planta de órgãos e cor é difícil devido à sua natureza quantitativa e quantificação muitas vezes subjetiva. TA fornece medidas objetivas e precisas de características morfológicas de frutas diversas e colorimétricas de uma forma de alto rendimento e semi-automáticas. A utilidade da TA tem sido demonstrada em estudos que levaram à identificação da forma do fruto de tomate QTL 2,4,5. Além disso, a classificação de cultivars6 ea taxonomia de um grupo de espécies foi avaliado utilizando a saída do TA 15,16. Alta expressão do fruto de tomate forma resultados gene dom em 17 frutos alongados. Utilizando forma de folha TA, e cotilédones foi determinada em linhas expressando dom a um alto nível 7, demonstrando que o aplicativo pode ser usado efetivamente para medir a morfologia de órgãos de outras plantas também. Além disso, TA tem sido muito importante na identificação da base genética do tamanho da semente de tomate e girassol 8,9. Por último, o módulo de teste de cores implementado em TA é mais preciso e exato, e menos caro do que outros métodos para analisar cor do fruto no tomate. Em resumo, a TA se tornou uma ferramenta fundamental para a avaliação objetiva e confiável da morfologia e da variação de cor dos órgãos da planta.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi suportada pelo National Science Foundation (DBI 0.227.541).
References
- Brewer, M. T. Development of a controlled vocabulary and software application to analyze fruit shape variation in tomato and other plant species. Plant Physiol. 141 (1), 15-25 (2006).
- Gonzalo, M. J. Tomato Fruit Shape Analysis Using Morphometric and Morphology Attributes Implemented in Tomato Analyzer Software Program. Journal of the American Society for Horticultural Science. 134 (1), 77-87 (2009).
- Darrigues, A. Tomato analyzer-color test: A new tool for efficient digital phenotyping. Journal of the American Society for Horticultural Science. 133 (4), 579-586 (2008).
- Brewer, M. T., Moyseenko, J. B., Monforte, A. J., van der Knaap, E. Morphological variation in tomato: a comprehensive study of quantitative trait loci controlling fruit shape and development. J Exp Bot. 58 (6), 1339-1349 (2007).
- Gonzalo, M. J., Knaap, E. vander A comparative analysis into the genetic bases of morphology in tomato varieties exhibiting elongated fruit shape. Theor Appl Genet. 116 (5), 647-656 (2008).
- Rodríguez, G. R. Diversity of SUN, OVATE and FAS in the tomato germplasm and their effect on fruit morphology (in preparation. , Forth Coming Forthcoming.
- Wu, S. Masters Thesis. , The Ohio State University. (2009).
- Orsi, C. H., Tanksley, S. D. Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species. PLoS Genet. 5 (1), e1000347-e1000347 (2009).
- Yue, B., Cai, X., Yuan, W., Vick, B., Hu, J. Mapping quantitative trait loci (QTL) controlling seed morphology and disk diameter in sunflower (Helianthus annuus L). Helia. 32, 17-35 (2009).
- Zeng, Z. B. Theoretical Basis for Separation of Multiple Linked Gene Effects in Mapping Quantitative Trait Loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (23), 10972-10976 (1993).
- Zeng, Z. B. Precision Mapping of Quantitative Trait Loci. Genetics. 136 (4), 1457-1468 (1994).
- Jiang, C. J., Zeng, Z. B. Multiple-Trait Analysis of Genetic-Mapping for Quantitative Trait Loci. Genetics. 140 (3), 1111-1127 (1995).
- International Plant Genetic Resources Institute. IPGRI Descriptors for Tomato (Lycopersicon spp.). , Roma, Italy. 47-47 (1996).
- International Union for the Protection of New Varieties of Plants. UPOV Guidelines for the Conduct of Tests for Distinctness, Uniformity, and Stability. TOMATO (Lycopersicon Lycopersicum (L.) Karsten Ex Farw.). , Geneva. 51-51 (2001).
- Depypere, L., Chaerle, P., Mijnsbrugge, K. V., Goetghebeur, P. Stony endocarp dimension and shape variation in Prunus section Prunus. Annals of Botany. 100 (7), 1585-1597 (2007).
- Depypere, L., Chaerle, P., Breyne, P., Mijnsbrugge, K. V., Goetghebeur, P., P, A combined morphometric and AFLP based diversity study challenges the taxonomy of the European members of the complex Prunus L. section Prunus. Plant systematics and evolution. 279 (1-4), 219-231 (2009).
- Xiao, H., Jiang, N., Schaffner, E., Stockinger, E. J., van der Knaap, E. A retrotransposon-mediated gene duplication underlies morphological variation of tomato fruit. Science. 319 (5869), 1527-1530 (2008).
